Шаламов Р. В. Биологическая химия,практикум

Лабораторная работа № 1

Тема: осаждение белков

Эксперимент № 1. Осаждение белков неорганическими кислотами.

В три пробирки внесите по 10 капель раствора яичного белка (разведенного в 10 раз). Добавьте в каждую пробирку по 2-3 капли концентрированной кислоты (серной, соляной, азотной). Добавьте еще кислоты. Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Эксперимент № 2. Осаждение белков органическими растворителями.

В две пробирки внесите по 10 капель раствора белка и добавьте в одну 10 капель спирта, в другую — столько же ацетона. Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Эксперимент № 3. Осаждение белков органическими кислотами.

В две пробирки внесите по 10 капель раствора белка и добавьте в одну 10 капель трихлоруксусной кислоты, в другую — столько же сульфосалициловой кислоты. Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Эксперимент № 4. Осаждение белков алкалоидными реактивами.

В две пробирки внесите по 10 капель раствора белка и по 5 капель 1 % раствора уксусной кислоты (объясните значение добавления кислоты). Затем добавьте в одну пробирку 5-7 капель пикриновой кислоты, в другую — столько же танина. Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Эксперимент № 5. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В три пробирки внесите по 10 капель раствора белка и добавьте в каждую по 2 капли одного из растворов солей (CuSO₄, FeCl₃, (CH₃COO)₂Pb). Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Эксперимент № 6. Осаждение белка солями щелочных металлов и аммонийными солями.

В две пробирки внесите по 10 капель раствора белка и добавьте в одну 10 капель насыщенного раствора сульфата натрия, в другую — столько насыщенного раствора сульфата аммония. Наблюдения запишите в тетрадь. Объясните происходящие явления.

Общее замечание: после добавления осадителей к растворам белка перемешайте смеси встряхиванием. Из каждой группы пробирок выберите одну, с наибольшим осадком, и проверьте растворимость осадка добавлением 20 капель дистиллированной воды.

Результаты оформите в виде таблицы. Сделайте вывод о том, какие из исследованных осадителей вызывают обратимое осаждение. Дайте объяснение своим выводам.

Лабораторная работа № 2

Тема: качественные реакции на белки и отдельные аминокислоты

Все качественные реакции выполняйте с сывороткой крови и с раствором желатины (в каждом случае по две пробирки: в одной 5 капель сыворотки, в другой — столько же раствора желатины).

Эксперимент № 1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского).

Данную реакцию дают все соединения, содержащие пептидную группу, т.е. все белки, пептиды и некоторые другие вещества. В щелочной среде пептидные группы образуют с сульфатом меди окрашенный в сине-фиолетовый цвет комплекс. Реакция используется как для качественного, так и для количественного анализа.

Механизм реакции:

мочевина биурет

CuSO₄ + 2NaOH → Cu(OH)₂↓ + Na₂SO₄

К растворам исследуемых белков добавьте по две капли 10 % раствора NaOH и по две капли 1 % раствора CuSO₄. Перемешайте. Наблюдения запишите в тетрадь.

Эксперимент № 2. Нингидриновая реакция.

Эту реакцию дают соединения, содержащие свободную α-аминогруппу, в том числе свободные аминокислоты, пептиды, белки. При нагревании с нингидрином происходит окисление указанных групп с образованием CO₂, NH₃ и соответствующих альдегидов. Нингидрин при этом восстанавливается.

Восстановленный нингидрин взаимодействует с аммиаком и второй молекулой нингидрина, в результате чего и образуется окрашенное соединение (пурпурный Руэманна):

.

К растворам исследуемых белков добавить по 3-5 капель 0,5 % раствора нингидрина, перемешать и нагреть до кипения. Наблюдения запишите в тетрадь.

Эксперимент № 3. Ксантопротеиновая реакция (реакция Мульдера).

Эту реакцию дают все белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты. При нагревании их с концентрированной азотной кислотой происходит нитрование ароматических колец. Образующиеся продукты имеют желтую окраску, при подщелачивании переходящую в оранжевую.

тирозин динитротирозин

К растворам исследуемых белков добавьте по 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно (!) нагрейте пробирки. В случае появления желтого окрашивания раствор охладите, и добавьте 30 % раствор NaOH или NH₄OH по каплям до появления оранжевого оттенка. Наблюдения запишите в тетрадь.

Эксперимент № 4. Реакция Адамкевича на триптофан.

Триптофан в кислой среде взаимодействует с альдегидами, образуя окрашенные продукты. В качестве источника альдегида можно использовать раствор сахарозы, которая при обработке кислотой дает оксиметилфурфурол, обладающий альдегидной группой, или ледяную уксусную кислоту, среди примесей в которой всегда присутствует глиоксиловая кислота. Реакция протекает по следующей схеме.

К исследуемым белковым растворам добавьте по 1-2 капли 10 % раствора сахарозы и слегка подогрейте. После остывания по стенке пробирке подслоите концентрированную серную кислоту. На границе раздела жидкостей появляется красновато-фиолетовое кольцо в случае наличия в белке триптофана. Наблюдения запишите в тетрадь.

Эксперимент № 5. Реакция Эрлиха на гистидин.

При смешивании реактивов 1 (раствор сульфаниловой кислоты в HCl) и 2 (водный раствор NaNO₂) друг с другом и с аммиаком образуется диазобензолсульфоновая кислота, дающая оранжевое окрашивание с гистидином.

К растворам исследуемых белков добавьте по 3 капли реактива 1, по 2-3 капли реактива 2 и по 3-5 капель любого щелочного раствора (NaHCO₃, NH₄OH, NaOH). Наблюдения запишите в тетрадь.

Эксперимент № 6. Реакция Фоля на серусодержащие аминокислоты.

Цистин, цистеин, метионин при нагревании с концентрированными растворами щелочей разрушаются с образованием сульфидов. При добавлении к их растворам ацетата свинца происходит образование сульфида свинца — нерастворимой соли черного цвета.

Взаимодействие белка с реактивом Фоля происходит по такой схеме:

(CH₃COO)₂Pb + 2NaOH → Pb(OH)₂↓ + 2CH₃COONa

Pb(OH)₂ + 2NaOH → Na₂PbO₂ + 2H₂O

цистеин серин

2NaOH + H₂S → Na₂S + 2H₂O

2NaOH + Na₂PbO₂ → PbS↓ + 4NaOH

К исследуемым белковым растворам добавьте по 5-7 капель 30 % раствора NaOH и по 1 капле 5 % раствора ацетата свинца. Нагрейте до кипения и осторожно кипятите 1-2 минуты. Затем в пробирку поместите немного волос или кусочек ногтя и обработайте вышеописанным способом. Наблюдения запишите в тетрадь. Сделайте выводы.

Эксперимент № 7. Реакция Миллона на тирозин.

С помощью реакции Миллона от­крывают наличие аминокислоты тирозина. Тирозин об­разует с реактивом Миллона ртутную соль нитротирозина красного цвета. Эта реакция характерна также почти для всех фенолов.

К 1 мл раствора фенола в пробирке прилейте 0,5 мл реактива Миллона и осторожно нагрейте. Появляется розовое окрашивание. В другую пробирку налейте 1—2 мл раствора яичного или растительного белка и 5-6 капель реактива Миллона, осторожно нагрейте. Жидкость окрасится в красный цвет, и затем вы­падает осадок кирпично-красного цвета. То же проделайте и с раствором желатины: крас­ного окрашивания не на ступает или оно проявляется очень слабо (если желатин не очищен от примеси других белков). Наблюдения запишите в тетрадь. Сделайте выводы.

Общее замечание: результаты работы отобразите в таблице, отмечая, какие реакции дал каждый из исследуемых белков. В выводах укажите различия аминокислотного состава этих белков и их относительную пищевую ценность.

Лабораторная работа № 3

Тема: углеводы

Эксперимент № 1. Взаимодействие моно- и дисахаридов с гидроксидом меди (ІІ).

Моно- и дисахариды реагируют с гидроксидом меди (ІІ) с образованием легко растворимых в воде сахаратов. Все они окрашены в синий цвет. Это качественная реакция на соединения с большим количеством гидроксильных групп.

В несколько пробирок (по количеству различных углеводов) налейте по 1 мл раствора гидроксида натрия и несколько капель раствора сульфата меди до образования осадка гидроксида меди (ІІ). Затем в каждую пробирку добавьте соответственно 0,5-1 мл раствора глюкозы, галактозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы. Наблюдения запишите в тетрадь. Сделайте выводы.

Эксперимент № 2. Взаимодействие углеводов с гидроксидом меди (ІІ) (реакция Тромера).

Моносахариды и восстанавливающие дисахариды окисляются в щелочной среде и восстанавливают гидроксид меди (ІІ) по такой схеме:

CuSO₄ + 2NaOH → Cu(OH)₂ + Na₂SO₄

CH₂OH-(CHOH)₄-CHO + 2Cu(OH)₂ →

CH₂OH-(CHOH)₄-COOH + 2CuOH + H₂O

2CuOH → Cu₂O↓ + H₂O

В пробирки (по количеству исследуемых) углеводов налейте по 1 мл растворов глюкозы, фруктозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, крахмала, добавьте такой же объем раствора гидроксида натрия и несколько капель сульфата меди до образования голубого осадка гидроксида меди (ІІ). Все пробирки осторожно нагрейте. Моносахариды и восстанавливающие дисахариды (лактоза и мальтоза) восстанавливают гидроксид меди (ІІ) до гидроксида меди (І) — осадок желтого цвета, который при длительном нагревании превращается в оксид меди (І) — осадок кирпично-красного цвета. Сахароза и крахмал (невосстанавливающие углеводы) не изменяют окраску гидроксида меди (ІІ). Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы о восстанавливающих свойствах углеводов в зависимости от химического строения.

Эксперимент № 3. Окисление моно- и дисахаридов в кислой среде.

Дисахариды окисляются медленнее моносахаридов и в кислой среде не восстанавливают соединения двухвалентной меди. Это можно выявить с помощью кислого реактива Барфеда, содержащего ацетат меди (ІІ) в кислой среде. При нагревании моносахаридов и восстанавливающих дисахаридов с реактивом Барфеда двухвалентная медь восстанавливается только с растворами моносахаридов:

CH₂OH-(CHOH)₄-CHO + 2(CH₃COO)₂Cu +2 H₂O →

CH₂OH-(CHOH)₄-COOH + Cu₂O↓ + 4 CH₃COOH

В первую пробирку налейте 1 мл раствора глюкозы, в другую — такой же объем лактозы, в третью — мальтозы. Добавьте во все пробирки по 1 мл реактива Барфеда и нагрейте. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Эксперимент № 4. Реакция Селиванова на определение кетоз.

Важнейшей кетозой является фруктоза. Она встречается в природе как в свободном (в составе меда) так и в связанном (в составе сахарозы, некоторых полисахаридов) состоянии. В живых организмах фруктоза превращается в глюкозу. Характерной реакцией на фруктозу и другие кетозы является реакция Селиванова. Суть реакции заключается в том, что при нагревании раствора кетозы с концентрированной соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, дающий с резорцином продут конденсации красного цвета. Эта реакция позволяет обнаруживать как свободные так и связанные кетозы.

В пробирку налейте 0,5 мл раствора фруктозы, добавьте 1 мл раствора Селиванова и несколько минут нагревайте смесь на водяной бане. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Эксперимент № 5. Ферментативный гидролиз сахарозы.

Фермент β-фруктофуранозидаза (инвертаза, сахараза) катализирует процесс расщепления сахарозы до глюкозы и фруктозы. Он содержится в пекарских дрожжах.

1-1,5 г пекарских дрожжей разотрите в ступке с 10-12 мл воды до получения однородной взвеси. К 2 мл взвеси прибавьте 2 мл воды и произведите реакцию Троммера (проверка восстанавливающей способности дрожжей).

В две пробирки налейте по 3 мл взвеси дрожжей; одну из них поставьте на 10 мин в кипящую водяную баню (для тепловой инактивации фермента) и потом охладите под краном, вторую не нагревайте. В обе пробирки добавьте по 3 мл 2%-ного раствора сахарозы и оставьте на 5-8 мин, после чего отфильтруйте. С фильтратами проде­лайте реакцию Троммера. Запишите результаты опыта.

Эксперимент № 6. Реакция крахмала с иодом.

Наиболее спе­цифическая реакция на крахмал — появление синего окрашивания с йодом. Окраска обусловлена амилозой. Хотя содержание амилопектина в зернах крахмала в не­сколько раз превышает количество амилозы, тем не ме­нее синее окрашивание, возникающее при действии йода на амилозу, перекрывает красно-фиолетовую окраску амилопектина. Окраска исчезает при нагревании и вос­станавливается при охлаждении крахмального клей­стера.

В пробирку наливают 1-2 мл 0,5 %-ного раствора крахмала и добавляют 1-2 капли раствора Люголя. Появляется на­сыщенное синее окрашивание. При нагревании синяя окраска исчезает, при охлаждении — восстанавли­вается.

Эксперимент № 7. Проверка восстанавливающих свойств крахмала.

В две пробирки налейте по 4-5 мл раствора крах­мала. В одну пробирку добавьте 3 капли концентриро­ванной соляной кислоты, во вторую — столько же ди­стиллированной воды (контроль). Обе пробирки поставьте на 10-15 мин в кипящую водяную баню. После охлаж­дения проведите реакцию Троммера. В первой пробир­ке выпадет красный осадок закиси меди, что свидетель­ствует о гидролитическом расщеплении крахмала и освобождении веществ, обладающих восстанавливаю­щими свойствами, во второй пробирке — реакция отри­цательная.

Лабораторная работа № 4

Тема: влияние различных факторов на активность ферментов

Для знакомства со свойствами ферментов используем амилазу слюны. Она катализирует гидролиз крахмала и гликогена и является эндополиглюкозидазой, разрушающей α-1,4-глюкозидные связи. В ходе ферментативного гидролиза крахмала образуются олигосахариды различной величины — декстрины. Следить за ходом гидролиза можно с помощью окрашивания реакционной смеси реактивом Люголя (раствор йода в водном растворе йодида калия). Крахмал окрашивается реактивом Люголя в синий цвет; раствор мутен. Декстрины имеют разную окраску в зависимости от их величины. Крупные амилодекстрины окрашены, как и крахмал, в синий цвет, но их растворы прозрачны и менее вязки, чем раствор крахмала. Средние по величине обломки молекул крахмала — эритродекстрины — окрашиваются в красный цвет. Мелкие ахродекстрины реактивом Люголя не окрашиваются (желтоватая окраска их растворов после обработки реактивом Люголя определяется цветом самого реактива). Конечный продукт гидролиза крахмала α-амилазой — мальтоза и небольшое количество ахродекстринов. Появление конечных продуктов можно обнаружить с помощью реакции Фелинга.

Эксперимент № 1. Влияние температуры на активность ферментов.

Поставьте в штатив 2 ряда пробирок (по 3 в ряду). Внесите в пробирки 1-го ряда (пробирки 1-3) по 2 мл 0,5 % раствора крахмала, а в пробирки 2-го ряда (пробирки 4-6) по 10 капель разведенной в 5-6 раз слюны. Пробирки 1 и 4 поставьте на 10 минут в лед; пробирки 2 и 5 — в термостат при 37º С; пробирки 3 и 6 — в кипящую водяную баню. Через 10 минут содержимое пробирок 1 и 4, 2 и 5, 3 и 6 объедините, тщательно перемешайте и оставьте на 10-15 минут. Добавьте в каждую по 3-5 капель реактива Люголя. Сравните окраску растворов в пробирках. Результаты оформите в виде таблицы. Сделайте вывод о влиянии температуры на активность ферментов.

Эксперимент № 2. Влияние рН на активность ферментов.

В четыре пробирки налейте по 1 мл буферных растворов, имеющих рН 5,0, 6,9, 7,5 и 8,2. В каждую пробирку добавьте по 5 капель 0,5 % раствора крахмала и по 1 капле слюны, предварительно разбавленной в 10 раз. Перемешайте и поместите в термостат или водяную баню при +37º С на 6-7 минут. Затем добавьте в каждую пробирку по 1 капле реактива Люголя и сравните окраску растворов. Результаты оформите в виде таблицы. Сделайте вывод о влиянии рН на активность ферментов.

Эксперимент № 3. Специфичность действия ферментов.

В одну пробирку налейте 1 мл 0,5 % раствора крахмала, в другую — 1 мл 0,5 % раствора сахарозы. В обе пробирки внесите по 5 капель разведенной в три раза слюны. Содержимое пробирок перемешайте и поставьте на 15 минут в термостат или водяную баню при 37º С. Затем проведите в обеих пробирках реакцию Фелинга, с помощью которой обнаруживаются свободные альдегидные группы. Указанные группы отсутствуют у сахарозы и негидролизованного крахмала, но появляются после гидролиза у продуктов расщепления.

Для выполнения реакции Фелинга добавьте к исследуемым растворам равные объемы реактива Фелинга и нагрейте (одновременно!) обе пробирки до появления красного или желтого осадка в одной из них. Сравните поведение двух растворов и сделайте выводы.

Реакция Фелинга. В этой реакции происходит окисление углеводов до соответствующих кислот с параллельным восстановлением Cu²⁺ до Cu⁺. Реакция идет в щелочной среде:

1) CuSO₄ + 2NaOH → ↓Cu(OH)₂ + Na₂SO₄;

2) CH₂OH(CHOH)₄CHO + 2Cu(OH)₂ → CH₂OH(CHOH)₄COOH + ↓Cu₂O + 2H₂O.

При этом выпадает осадок кирпично-красного цвета — закись меди.

В 8 пробирок внесите по 2 мл растворов глюкозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, какой-либо из пентоз, крахмала. Добавьте в каждую по 1 мл раствора Фелинга (содержит CuSO₄, NaOH и сегнетову соль для связывания избытка меди). Перемешайте. Нагрейте в пламени горелки или кипящей водяной бане до появления в некоторых пробирках кирпично-красного осадка закиси меди или желтого осадка гидрата закиси меди.

Проведите реакцию Фелинга также и с гидролизованными сахарозой и крахмалом. Для гидролиза сахарозы к 1 мл раствора этого углевода добавьте 0,5 мл 10 % раствора H₂SO₄ и кипятите 1-2 минуты. Кислоту нейтрализуйте 1 мл 10 % раствора NaOH. Аналогично гидролизуйте 2 мл крахмала.

Лабораторная работа № 5

Тема: наблюдение действия некоторых ферментов

Эксперимент № 1. Действие уреазы.

Уреаза относится к классу гидролитических ферментов, катализирующих гидролиз связей —C—N—. Уреаза расщепляет мочевину согласно уравнению:

CO(NH₂)₂ + H₂O CO₂ + 2NH₃.

В большом количестве уреаза имеется в соевых бобах. В небольшом количестве уреаза присутствует в желудочном соке человека.

Налейте в две пробирки по 2 мл 2 % раствора мочевины и по 2-3 капли фенолфталеина. В одну из них добавьте щепотку соевой муки. Перемешайте. Вторая пробирка служит контролем. Обе пробирки оставьте при комнатной температуре и наблюдайте за окраской растворов. Сделайте выводы.

Эксперимент № 2. Действие дегидрогеназ.

Дегидрогеназы относятся к классу оксидоредуктаз. Они катализируют окисление различных субстратов путем отнятия водорода и переноса его на различные акцепторы. Действие дегидрогеназ удобно наблюдать в анаэробных условиях, используя в качестве акцептора водорода метиленовый синий. Этот краситель легко окисляется и восстанавливается, изменяя при этом цвет (восстановленная форма бесцветна и называется лейкоформой, окисленная — окрашена в синий цвет и называется хромоформой). Сукцинатдегидрогеназа — весьма растпространенный фермент в тканях животных организмов. Он входит в состав внутренней митохондриальной мембраны. Катализирует реакцию окисления янтарной кислоты (сукцината) до фумаровой (фумарата). Это один из важнейших этапов метаболизма мышц в анаэробных условиях. По своей химической природе этот фермент является флавопротеидом, коферментом которого является флавинадениндинуклеотид (ФАД) — акцептор водорода при окислении янтарной кислоты:

В клетках живых организмов акцептором электронов, отщепляющихся от Е-ФАДН₂, является цитохромная система ферментов. Однако восстановленные флавиновые дегидрогеназы легко окисляются и искусственными акцепторами электронов, например, метиленовым синим (Мс):

Е-ФАДН₂ + Мс → Е-ФАД + МсН₂

По этой реакции можно качественно и количественно определить активность флавиновых дегидрогеназ, в частности сукцинатдегидрогеназы.

У декапитированной крысы извлеките мышцы и измельчите их ножницами. Поместите мышечную кашицу в две пробирки. В одну добавьте 1 мл воды, нагрейте до кипения и кипятите 2-3 минуты, после чего слейте воду. В обе пробирки добавьте раствор метиленового синего так, чтобы покрыть мышцы. Сверху наслоите тонкий слой растительного масла для создания анаэробных условий. Поместите пробирки в термостат (+37º С) на 20-30 минут. Сравните окраску в пробирках. Объясните наблюдаемую картину. Встряхните пробирки и пронаблюдайте за изменением окраски. Дайте пояснения и сделайте выводы.

Эксперимент № 3. Действие каталазы крови и определение ее активности.

Каталаза — фермент из класса оксидоредуктаз — катализирует реакцию разложения пероксида водорода:

2Н₂О₂ 2Н₂О + ↑О₂.

Активность каталазы крови выражается так называемым каталазным числом — количеством мг пероксида водорода, которое разлагается ферментом, содержащимся в 1 мкл крови, при комнатной температуре за 30 минут.

Подопытное животное декапитируйте и соберите кровь в подготовленную посуду, ополоснутую антикоагулянтом (например, раствором цитрата натрия). В мерную колбу на 100 мл налейте немного дистиллированной воды. Внесите туда же микропипеткой, ополоснутой антикоагулянтом, 0,1 мл крови. Пипетку ополосните водой дважды, и промывные воды слейте в ту же колбу. Доведите объем водой до метки. Т.о., кровь разведена вами в 1000 раз.

В два стаканчика внесите по 5 мл воды и отмерьте туда же по 1 мл разведенной крови. Содержимое одной из проб (контрольной) прокипятите в течение 2-3 минут для инактивации каталазы. Охладите до комнатной температуры. В обе пробы добавьте по 2 мл 1 % раствора пероксида водорода и оставьте при комнатной температуре на 30 минут.

Добавьте в каждую пробу по 5 мл 10 % раствора серной кислоты. Оттитруйте перекись водорода 0,1 N раствором перманганата калия:

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 3H₂SO₄ → K₂SO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + ↑5O₂.

Зная разность объемов раствора перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб, концентрацию раствора перманганата калия, разведение крови и эквивалентную массу пероксида водорода, рассчитайте каталазное число. Сделайте выводы.

Лабораторная работа № 7

Тема: выделение липидов и исследование их некоторых свойств

Эксперимент № 1. Растворимость триацилглицеролов (нейтральных жиров).

Триацилглицеролы не растворяются в воде, но хорошо растворяются во многих органических растворителях. Большинство жиров плохо растворяется в этаноле на холоде, и лучше при нагревании.

Возьмите две серии пробирок по четыре в каждой серии. В первую серию пробирок (№№ 1-4) поместите по небольшому кусочку, приблизительно с горошину, говяжьего жира, в пробирки второй серии (№№ 5-8) налейте по несколько капель растительного масла. Затем в первую пробирку каждой серии налейте по 1-2 мл дистиллированной воды, во вторую — диэтилового эфира, в третью — хлороформа, в четвертую — спирта. Все пробирки тщательно перемешайте и наблюдайте за растворимостью жиров в различных растворителях. Если жир не растворяется, поместите пробирки на 4-5 минут в кипящую водяную баню и наблюдайте влияние температуры на растворимость жиров. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Эксперимент № 2. Эмульгирование триацилглицеролов (жиров).

При продолжительном взбалтывании жиры с водой образуют неустойчивые эмульсии. Устойчивость эмульсий значительно повышается при добавлении эмульгаторов. К эмульгаторам относятся белки, желчные кислоты, мыла, щелочи и др. Адсорбируясь на поверхности жировых капель, эмульгаторы образуют тонкую пену, препятствующую слиянию отдельных мелких капель жира в большие. Образование эмульсий имеет большое биологическое значение. Например, жиры в пищеварительной трубке эмульгируются с помощью желчных кислот, что обеспечивает их переваривание. Несвежие жиры легче образуют устойчивые эмульсии, что обусловлено большим количеством свободных жирных кислот, образующихся при спонтанном гидролизе жиров при хранении.

В 5 пробирок налейте по 2-3 мл воды и добавьте в каждую из них по 4-5 капель свежего растительного масла. Во вторую пробирку добавьте 4-5 капель раствора гидроксида калия, в третью — 4-5 капель раствора карбоната натрия, в четвертую — 4-5 капель желчи, в пятую — 4-5 капель стандартного раствора белка. Содержимое всех пробирок старательно перемешайте. Аналогично проведите эксперимент с несвежим растительным маслом. Наблюдайте за образованием и устойчивостью эмульсий при добавлении эмульгаторов. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы о зависимости устойчивости эмульсий от свежести жира и от действия эмульгаторов.

Эксперимент № 3. Омыление триацилглицеролов в водно-спиртовом растворе.

Поскольку жиры являются сложными эфирами, они омыляются по схеме:

При омылении жира в щелочной среде образуются глицерин и мыла (соли высших жирных кислот). Эта реакция протекает медленно. Однако при добавлении спирта резко ускоряется, поскольку увеличивается растворимость жира, и смесь становится однородной. Глицерин и спирт, кроме того, растворимы в растворе хлорида натрия, мыло же не растворяется и выпадает в осадок в виде твердой массы (явление высоливания мыла). Из жидких жиров образуются более мягкие мыла.

В пробирку поместите приблизительно 3 г жира и добавьте 3 мл этилового спирта и 3 мл концентрированного раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки старательно взболтайте и нагрейте на водяной бане до начала кипения. Смесь становится однородной, и через 5-7 минут омыление заканчивается. К полученной густой массе добавьте при перемешивании горячий насыщенный раствор хлорида натрия. Дайте отстояться и наблюдайте за выделением слоя мыла, всплывающего на поверхность. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы об условиях образования мыла при омылении жиров.

Эксперимент № 4. Качественная реакция на глицерин в составе жиров (акролеиновая проба).

При термическом разложении жиров образуется смесь веществ, в том числе и свободный глицерин. Под действием водоотнимающих (гигроскопичных) веществ, например, гидросульфата калия, глицерин превращается в ненасыщенный альдегид — акролеин, бесцветное летучее вещество с резким неприятным запахом. Реакция происходит по схеме:

Эту реакцию используют для открытия глицерина как в свободном состоянии, так и в составе молекулы жира.

В сухую пробирку поместите 3-4 кристаллика безводного гидросульфата калия, добавьте 1-2 капли жира и нагрейте до появления характерного неприятного запаха акролеина. Наблюдения занесите в тетрадь и сделайте вывод о значении акролеиновой пробы.

Эксперимент № 5. Определение кислотного числа жира.

Природные нейтральные жиры всегда имеют примеси свободных жирных кислот. Количество их увеличивается при прогоркании жира. Поэтому для оценки пищевой пригодности жира применяется определение количества указанных веществ, выражаемое в так называемом кислотном числе жира. Кислотное число — это количество мг КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Внесите в колбу 1 мл растительного масла. Добавьте 5 мл эфира, 5 мл этилового спирта и 2-3 капли фенолфталеина. Оттитруйте кислоты 0,01 N спиртовым раствором КОН до розовой окраски. Рассчитайте кислотное число с учетом плотности подсолнечного масла (0,94 г/мл).

Эксперимент № 6. Определение йодного числа жира.

Количество ненасыщенных жирных кислот в жире во многом определяет его пищевую ценность. Степень насыщенности жира определяется с помощью насыщения содержащихся в нем непредельных кислот йодом и определения непрореагировавшего йода (йодометрия). Йодное число — это количество граммов йода, которое связывается непредельными жирными кислотами, содержащимися в 100 г жира. В клинической биохимии иногда определяют йодное число сыворотки или цельной крови и выражают его в мг% (количество мг йода, связавшегося с непредельными жирными кислотами, содержащимися в 100 мл крови или сыворотки). В норме йодное число цельной крови колеблется от 340 до 420, сыворотки — от 370 до 700 мг%.

Внесите в колбу 0,2 мл растительного масла (опыт); во вторую колбу — 0,2 мл воды (контроль). Добавьте в обе по 10 мл хлороформа и по 10 мл 0,1 N спиртового раствора йода. Перемешайте и оставьте на 15 минут. Оттитруйте не связавшийся с пробами йод 0,1 N раствором гипосульфита натрия сначала до появления темно-желтой окраски, а затем, после добавления 1 мл 1 % раствора крахмала, до исчезновения синего оттенка. Исходя из разницы объемов раствора гипосульфита натрия, пошедшего на титрование опытной и контрольной проб, концентрации указанного раствора, эквивалентной массы йода, навески жира в граммах, определите йодное число. Сделайте выводы.

Эксперимент № 7. Выделение лецитина (фосфатидилхолина) из яичного желтка.

Поместите в пробирку немного яичного желтка (можно кусочек сухого желтка). Залейте 3-4 мл эфира. Встряхивайте 5-10 минут. Эфир экстрагирует липиды, в том числе и лецитин. Дайте смеси отстояться и слейте экстракт. К эфирному экстракту прилейте равный объем ацетона и взболтайте смесь. Лецитин выпадает в осадок в виде белых хлопьев. На этом принципе основано препаративное получение лецитина.

Эксперимент № 8. Реакция Либермана на холестерол.

Внесите в сухую пробирку 10 капель 10 % хлороформного раствора холестерола. Добавьте 1-2 капли уксусного ангидрида и 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Осторожно встряхните и поместите в кипящую водяную баню на 1-2 минуты, или оставьте при комнатной температуре на 5-7 минут. Развивается зеленая окраска, обусловленная образованием холестеролсульфокислоты. Данная цветная реакция лежит в основе количественного определения холестерола в тканях и крови.

Лабораторная работа № 8

Тема: обмен липидов — качественные реакции на определение желчных кислот, желчных пигментов и кетоновых тел

Качественные реакции на определение желчных кислот. Переваривание жиров включает эмульгирование и гидролитическое расщепление их на глицерин и высшие жирные кислоты. В процессе эмульгирования, расщепления и дальнейшего всасывания высших жирных кислот большое значение имеет желчь. Основными компонентами желчи, определяющими ее роль в этих процессах, являются желчные кислоты. По своей химической природе желчные кислоты являются производными холановой кислоты (содержат стеро идное ядро — циклопентанпергидрофенантрен). К желчным кислотам относятся холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая и некоторые другие кислоты. Биологическое действие проявляют соли желчных кислот, образующие соединения с аминокислотами глицином и таурином.

Эксперимент № 1. Реакция Петенкофера на желчные кислоты.

Реакция основана на способности желчных кислот при взаимодействии с оксиметилфурфуролом, образующимся при гидролизе сахарозы в присутствии серной кислоты, давать красную окраску.

В пробирку налейте 5 мл разбавленной желчи и добавьте при перемешивании 1-2 капли раствора сахарозы. Осторожно наслоите 1 мл концентрированной серной кислоты. Между слоями кислоты и желчи образуется красно-фиолетовое кольцо. При осторожном перемешивании содержимого пробирки появляется пурпурно-красная окраска. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Эксперимент № 2. Определение поверхностного натяжения желчных кислот.

Соли желчных кислот уменьшают поверхностное натяжение жидкости, в которой они растворены. Если к воде и сере, нерастворимой в воде, добавить желчь, поверхностное натяжение уменьшится, сера намочится водой и вследствие своей высокой плотности опустится на дно. Чем большее содержание желчи, тем большая скорость погружения серы.

В первую пробирку налейте 10 мл дистиллированной воды, во вторую — 10 мл разбавленной желчи 1:5, в третью — 10 мл разбавленной желчи 1:10. на поверхность всех жидкостей насыпьте порошок серы. В чистой воде сера остается на поверхности, а в разбавленной желчи опускается на дно, но с разной скоростью. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Качественные реакции на определение желчных пигментов. Желчные пигменты — билирубин и биливердин — образуются в печени в процессе разложения гема — небелковой части белка крови — гемоглобина. При этом выделяется железо и образуется биливердин, восстанавливающийся в печени до билирубина — основного желчного пигмента человека. Затем желчные пигменты преобразуются в кишечнике, образуя стеркобилиноген. Желчные пигменты можно определить с помощью азотистой кислоты. Под действием азотистой кислоты они окисляются с образованием продуктов, окрашенных в синий, зеленый и желтый цвета. Качественный и количественный анализ желчных пигментов в крови и моче имеют важное диагностическое значение для определения функционального состояния печени.

билирубин

Эксперимент № 3. Проба Гмелина на желчные пигменты.

В пробирку налейте 1 мл желчи. Осторожно по стенке пробирки наслоите 0,5-1 мл концентрированной азотной кислоты, содержащей азотистую. Наблюдайте за образованием цветных колец на границе жидкостей. Зеленые, синие, фиолетовые, красные, желтые кольца соответствуют разным стадиям окислениям желчных пигментов. Реакцию Гмелина можно осуществить и на фильтровальной бумаге. Для этого на небольшой кусочек фильтровальной бумаги наносят каплю желчи и дают подсохнуть. Затем на средину пятна нанесите каплю концентрированной азотной кислоты, содержащей азотистую. Наблюдайте за появлением колец желчных пигментов. Наблюдения запишите в тетрадь, сделайте выводы.

Качественные реакции на кетоновые тела. В процесс метаболизма высших жирных кислот они превращаются в ацетил-КоА, окисляющийся в цикле Кребса до СО₂ и Н₂О. через ацетил-КоА происходят взаимопревращения углеводов и липидов. Из ацетил-КоА образуются также и кетоновые тела, к которым относятся ацетоуксусная кислота, β-гидроксимасляная кислота и ацетон:

ацетоуксусная кислота и β-гидроксимасляная кислота — важные транспортные формы метаболитов липидного обмена. Из печени они поступают в кровь, затем в мышцы, где и окисляются. Высшие жирные кислоты — один из важнейших источников энергии при продолжительной мышечной работе и в период отдыха после физических нагрузок. Ацетон в организме здорового человека образуется в очень низких концентрациях и не имеет определенной физиологической роли. В крови здорового человека все кетоновые тела содержатся в небольших концентрациях. Однако при диабете или при длительном голодании содержание кетоновых тел в крови значительно увеличивается (кетонемия), что вызывает появление больших количеств кетоновых тел в моче (кетонурия) — до 10-50 г за сутки. Кетоновые тела в моче можно определить с помощью характерных цветных реакций. Наиболее распространенными пробами на кетоновые тела являются реакция с нитропруссидом натрия (реакция Легаля-Ланге) на ацетоуксусную кислоту и ацетон, реакция с хлорным железом на ацетоуксусную кислоту, реакция с йодом (проба Либена) на ацетон, реакция окисления β-гидроксимасляной кислоты в ацетоуксусную.

Эксперимент № 4. Качественная реакция с нитропруссидом натрия.

В щелочной среде ацетоуксусная кислота, как и ацетон, образует с нитропруссидом натрия продукты реакции, окрашенные в оранжево-красный цвет. При добавлении уксусной кислоты окраска переходит в вишнево-красную:

CH₃COCH₃ + Na₂[Fe(CN)₅NO] + 2NaOH →

Na₄[Fe(CN)₅NO=CH₂COCH₃]_{(оранжево-красный)} + 2H₂O

Na₄[Fe(CN)₅NO=CH₂COCH₃] + CH₃COOH →

Na₃[Fe(CN)₅NO=CH₂COCH₃]_{(вишнево-красный)} + CH₃COONa

В пробирку налейте 1-2 мл исследуемой мочи, добавьте несколько капель раствора нитропруссида натрия и несколько капель гидроксида натрия. Наблюдайте окрашивание. Добавьте уксусной кислоты и наблюдайте изменение окраски. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы.

Эксперимент № 5. Качественная реакция на ацетоуксусную кислоту.

Реакция основана на взаимодействии ацетоуксусной кислоты и хлорного железа с образованием соединения красного цвета.

К 2-3 мл мочи добавьте по каплям 5 %-ый раствор хлорного железа. Выпавший осадок отфильтруйте. К фильтрату добавьте еще несколько капель раствора хлорного железа. При наличии ацетоуксусной кислоты наблюдайте появление красной окраски. Наблюдения запишите в тетрадь, сделайте выводы.

Лабораторная работа № 9

Тема: гидролиз рибонуклеопротеидов и качественные реакции на составные части мононуклеотидов

Эксперимент № 1. Гидролиз рибонуклеопротеидов из дрожжей.

Гидролиз рибонуклеопротеидов может происходить как под влиянием соответствующих ферментов, так и при кипячении в присутствии кислоты (в течение 1-1,5 часов). Сначала, при частичном гидролизе, нуклеопротеиды распадаются на белки и нуклеиновую кислоту. В свою очередь, нуклеиновые кислоты распадаются на отдельные мононуклеотиды, постепенно расщепляющиеся на азотистые основания, углеводный компонент и фосфорную кислоту. Белок в это время гидролизуется до низкомолекулярных пептидов и даже до аминокислот.

1-1,5 г пекарских дрожжей поместите в колбу, добавьте 30-40 мл раствора серной кислоты, закройте пробкой с обратным воздушным холодильником (стеклянная трубка длиной 25-30 см) и осторожно нагрейте до кипения¹. Кипятите смесь 1-1,5 часа, после чего охладите колбу. Полученный гидролизат рибонуклеопротеидов отфильтруйте и проанализируйте продукты гидролиза.

Эксперимент № 2. Определение пуриновых оснований.

Реакция основана на образовании серебряных солей пуриновых оснований, выпадающих в осадок при взаимодействии аденина и гуанина с гидроксидом диаммиаката серебра.

К 1 мл гидролизата добавьте несколько капель раствора аммиака до образования щелочной реакции по лакмусу и 0,5 мл раствора гидроксида диаммиаката серебра. Наблюдайте постепенное образование белого пластинчатого осадка серебряных солей пуриновых оснований. Наблюдения занесите в тетрадь и сделайте вывод о возможности использования проделанной реакции для открытия аденина и гуанина.

Эксперимент № 3. Определение углеводного компонента.

В пробирку налейте 0,5 мл гидролизата, нейтрализуйте его раствором гидроксида натрия до щелочной реакции. К нейтрализованному гидролизату добавьте 0,5 мл реактива Фелинга и нагрейте пробирку. Наблюдайте положительную реакцию Фелинга. Наблюдения занесите в тетрадь и сделайте вывод о наличии углеводного компонента в составе нуклеопротеидов.

Эксперимент № 4. Определение фосфорной кислоты.

Анион фосфорной кислоты (РО₄^3-) при взаимодействии с молибдатом аммония образует комплексную фосфорно-молибденовую кислоту — кристаллический осадок лимонно-желтого цвета.

К 0,5 мл гидролизата добавьте такой же объем молибденового реактива и прокипятите. Охладите пробирку под холодной водой и наблюдайте выпадение осадка фосфорно-молибденовой кислоты. Наблюдения занесите в тетрадь и сделайте выводы о возможности открытия фосфат-ионов с помощью проделанной реакции.

Лабораторная работа № 10

Тема: обнаружение минеральных вещества в биологических объектах

Эксперимент № 1. Качественное определение кальция и магния в моче.

Кальций, содержащийся в моче, можно определить по образованию осадка оксалата кальция при добавлении к подкисленной моче раствора оксалата аммония:

CaCl₂ + (NH₄)₂C₂O₄ → ↓CaC₂O₄ + 2NH₄Cl

Выделив фильтрованием оксалат кальция, определяют магний. Для этого к фильтрату добавляют аммиак. Через время выпадает осадок:

Na₂HPO₄ + MgCl₂ + NH₄OH → ↓MgNH₄PO₄ + 2NaCl + H₂O

В пробирку налейте 1-2 мл мочи, добавьте 2 капли 10 %-ного раствора уксусной кислоты и 5 капель 5 %-ного раствора оксалата аммония. Образовавшийся осадок выделите фильтрованием, а к фильтрату добавьте 4 капли 10 %-ного раствора аммиака. Через определенное время магний выпадет в осадок в виде ортофосфата магния-аммония. Наблюдения запишите в тетрадь и сделайте выводы о наличии солей кальция и магния в моче.

Эксперимент № 2. Определение кальция в моче титриметрическим методом с применением мурексида.

В основе метода лежит образование мурексидом комплексного соединения красноватого цвета с ионами кальция в щелочной среде. При титровании раствором более сильного комплексообразователя этот комплекс разрушается и мурексид освобождается, что приводит к появлению его натуральной окраски сине-фиолетового цвета.

В конусную колбу на 100 мл налейте 3 мл мочи. Добавить 47 мл дистиллированной воды, 5 мл 10 % раствора NaOH и 2 мл 0,5 % раствора мурексида. Медленно титруйте 0,002 М раствором трилона Б из микробюретки до появления сине-фиолетовой окраски. Параллельно с опытной пробой приготовьте контрольную пробу для контроля окраски свободного мурексида в щелочной среде. Для этого вместо мочи возьмите 3 мл воды и добавьте все перечисленные компоненты. Исходя из концентрации раствора трилона Б, его объема, пошедшего на титрование опытной пробы, и эквивалентной массы кальция рассчитайте содержание кальция в пробе. Обычно конечный результат выражают в количестве мг кальция, выводимого с мочой за сутки, для чего определение ведут в суточной моче и учитывают суточный диурез.

Эксперимент № 3. Обнаружение фосфора в моче и сыворотке крови по восстановлению фосфорно-молибденовой кислоты.

К 1 мл разбавленной в 10 раз мочи и к 1 мл сыворотки крови добавьте 4 мл дистиллированной воды и 5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для осаждения белков. Тщательно перемешайте. Через 10 минут профильтруйте растворы. К 5 мл фильтрата добавьте 1 мл раствора молибдата аммония, 0,2 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и 1,8 мл дистиллированной воды. Параллельно с опытными пробами проведите цветную реакцию со стандартным раствором, содержащим 0,439 г КН₂РО₄ в 1 л (0,1 мг фосфора в 1 мл раствора). К 1 мл стандартного раствора добавьте 2,5 мл ТХУ, 1 мл раствора молибдата аммония, 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты и 3,3 мл воды. Сравните окраску стандартного и опытных растворов. Сделайте выводы. Данная методика используется для количественного определения фосфора.

Лабораторная работа № 11

Тема: витамины

Эксперимент № 1. Исследование восстанавливающих свойств аскорби­новой кислоты.

Легко вступая в окислительно-восстано­вительные реакции, аскорбиновая кислота восстанавли­вает метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, железосинеродистый калий, азотнокислое серебро и другие вещества. Это свойство положено в основу качественных реакций на витамин С.

Метиленовую синь аскорби­новая кислота восстанавливает на свету в бесцветное соединение (лейкоформу), окисляясь в дегидроаскорбиновую кислоту.

К 1 мл свежеотжатого сока картофеля или капусты² добавьте 1-2 капли 0,01 %-ного раствора метиленовой сини и 2-3 капли 5 %-ного раствора соды. Пробирку слегка подогрейте. Наблюдайте обесцвечивание синей окраски. Сделайте выводы, результаты запишите в тетрадь.

Эксперимент № 2. Качественные реакции на вещества Р-витаминного действия.

К веществам Р-витаминного дейст­вия относится ряд соединений фенольной природы, ос­новное физиологическое действие которых заключается в уменьшении проницаемости и повышении прочности стенок кровеносных капилляров. Они способствуют усвояемости аскорбиновой кислоты в организме человека и животных. Биофлавоноиды принимают активное уча­стие в окислительно-восстановительных процессах, обла­дают антиокислительными свойствами, задерживая, в ча­стности, окисление гормона мозгового слоя надпочечни­ков адреналина. Вещества Р-витаминного действия инак-тивируют фермент гиалуронидазу, которая катализирует процесс распада гетерополисахарида — гиалуроновой хислоты. Гиалуроновая кислота входит в состав основно­го вещества соединительной ткани.

Установлено, что витаминными свойствами обладает ряд флавонолов (рутин, кверцетин), флаванонов (эриодиктин и его метиловый эфир гесперидин), катехинов (l-эпикатехин, эпикатехингалл ат и др.), кумаринов (эскулин и др.), галловая кислота и ее производные, антоцианы (красящие вещества плодов, ягод и цветов).

К группе веществ Р-витаминного действия следует также отнести агликоны ряда растительных пигментов — антоцианидины (например, цианидин — агликон циани­на, пигмента, весьма распространенного в цветках и пло­дах ряда высших растений) и лейкоантоцианы.

Биофлавоноиды широко распространены в раститель­ном мире. Ими богаты многие плоды и ягоды (цитрусо­вые, черная смородина, шиповник, голубика, черника, брусника, рябина, клюква и др.), листья чайного расте­ния, гречиха (особенно в период цветения), рута и др.

Реак­ция с хлорным железом. Хлорное железо обра­зует с рутином комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. Реакция характерна для мно­гих полифенолов. Обычно зеленую окраску дают соеди­нения, содержащие ортодиоксифенольные группы. Окра­шенный комплексный ион, образующийся при реакции рутина или кверцетина с хлорным железом, имеет сле­дующее строение:

К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина при­бавляют несколько капель 1 %-ного раствора хлорного железа (FeCl₃ • 6Н₂О). Появляется зеленое окрашивание.

Капельный метод определения катехинов в яблоках и грушах (по Л. И. Вигорову). Катехины, реагируя с солянокислым раствором ванилина, образуют соедине­ния, окрашенные в розовый или красный цвет. Исполь­зуя указанную реакцию, можно очень быстро определить приблизительное содержание катехинов в яблоках или грушах.

Куски хроматографической бумаги (10x10 см) про­питайте 1 %-ным раствором сернистокислого натрия и высушите. Через всю толщу мякоти плодов вырежьте полулунные ломтики, доходящие до семенных камер. Из ломтиков отожмите сок. Каплю сока нанесите на хроматографическую бумаг. Бу­магу высушите на воздухе (высушивание можно уско­рить комнатным вентилятором или феном). Высушенную, бумагу опрыскайте солянокислым раствором ванилина (10 мг ванилина в 10 мл концентрированной соляной кислоты). В зависимости от содержания катехинов в плодах места нанесения капель на бумагу принимают розовое, светло-красное или красное окрашивание.

Эксперимент № 3. Качественные реакции на рибофлавин (витамин В₂).

Витамин В₂ — один из важнейших участников окислительно-восстановительных процессов в организме. Он входит в состав активной группы основных окислительно-восстановительных ферментов, участвую­щих в переносе водорода; очень тесно связан с обменом белковых веществ.

Восста­новление рибофлавина. Рибофлавин легко окис­ляется и восстанавливается. При восстановлении его во­дородом образуется бесцветное соединение — лейкофлавин, которое, окисляясь, превращается в рибофлавин.

К 1 мл 0,015 %-ного раствора рибофлавина добавьте 10 капель концентрированной соляной кислоты и кусочек металли­ческого цинка. Под влиянием выделяющегося водорода окраска раствора постепенно меняется: из желтой пре­вращается сначала в зеленую, затем в малиновую, ро­зовую, и, наконец, наступает обесцвечивание. Через не­сколько минут верхний слой жидкости в пробирке снова принимает желтое окрашивание (окисление лейкофлавина в рибофлавин).

Реакция с азотнокислым серебром. Ней­тральные или слабокислые растворы рибофлавина (рН 6,5-7,2), реагируя с азотнокислым серебром, дают со­единение, окрашенное в розовый и красный цвет.

К 1 мл раствора рибофлавина добавьте 0,5 мл 0,1 %-ного рас­твора азотнокислого серебра. Появляется розовое или красное окрашивание (интенсивность окраски зависит от концентрации рибофлавина в растворе).

Эксперимент № 4. Качественные реакции на никотиновую кислоту.

Реакция с уксуснокислой медью. Никотино­вая кислота, реагируя с солями меди в уксуснокислой среде, образует медную соль никотиновой кислоты (никотинат меди) синего цвета

.

К 2 мл 0,75 %-ного раствора никотиновой кислоты добавляют 1 мл 15 %-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до начала кипения, после чего прилейте 1-1,5 мл 5 %-ного рас­твора уксуснокислой меди. В пробирке сначала появля­ется голубоватая муть, а затем выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.

Реакция с углекислым натрием. При на­гревании никотиновой кислоты с безводным углекислым натрием появляется специфический неприятный запах пиридина.

В небольшом фарфоровом тигле смешайте 0,05 г никотиновой кислоты с 0,1-0,15 г безводного углекисло­го натрия и подогрейте. Появляется резкий запах пи­ридина.

Эксперимент № 5. Качественные реакции на витамин В₆.

Известны три вещества, обладающие свойствами витамина В₆: пиридоксол (пиридоксин), пиридоксаль и пиридоксамин. Все они являются производными пиридина. Эти вещества устойчивы к высокой тем­пературе, действию кислот и щелочей, разрушаются сол­нечным светом.

Пиридоксаль и пиридоксамин играют важную роль в обмене аминокислот. Их фосфорилированные производ­ные (фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин) облада­ют коферментными функциями и катализируют реакции переаминирования (трансаминирования), декарбоксилирования, рацемизации и элиминации аминокислот. Имеются данные, свидетельствующие о коферментной функции фосфопиридоксаля в реакциях синтеза нико­тиновой кислоты из триптофана, образования триптофа­на из аминокислоты серина и индола, а также обмена метионина, цистеина, глютаминовой и других аминокис­лот. Витамин В₆ участвует также в обмене липидов.

Реакция витамина В₆ с хлорным железом. Витамин В₆ образует с хлорным железом комплекс, окрашенный в красный цвет.

К 4-5 мл 0,5 %-ного раствора пиридоксина прилейте 1 мл раствора хлорного железа и перемешайте. Развивается красная окраска.

Приложения

1. Реактив Люголя (раствор йода в растворе йодида калия). Растворите 1 г йода и 2,5 г йодида калия в 20 мл воды. Доведите водой объем раствора до 100 мл.

2. Реактив Барфеда. 13,3 г ацетата меди растворите в 200 мл горячей воды. Отфильтруйте и добавьте к фильтрату 1,9 мл ледяной уксусной кислоты.

3. Реактив Селиванова. 0,05 г резорцина растворите в 100 мл разбавленной соляной кислоты.

4. Реактив Фелинга. Состоит из растворов А и Б. Раствор А: 3,5 г медного купороса растворите в 50 мл воды. Раствор Б: 17,3 г сегнетовой соли и 6 г гидроксида натрия растворяют в 50 мл воды. Растворы А и Б хранят отдельно. Перед использованием растворы А и Б перемешивают в равных объемах.

5. Раствор гидроксида диаммиаката серебра. К 1-2 %-му раствору нитрата серебра добавьте по каплям 10 %-й раствор аммиака до растворения выпавшего сначала осадка.

6. Молибденовый реактив. Перемешайте 15 %-й раствор молибдата аммония с концентрированной азотной кислотой в соотношении 11 : 9.

7. Реактив Миллона. 40 г ртути растворяют в 57 мл концентрированной азотной кислоты вначале при комнатной температуре, затем сла­бо подогревая на водяной бане. Раствор разбавляют дву­мя объемами воды, и после отстаивания сливают с осадка.

Приготовление растворов белка

Раствор яичного белка для цветных реакций и реак­ций осаждения. Белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15—20-кратном объеме дистилли­рованной воды. Раствор фильтруют через марлю, сложен­ную в 3—4 слоя. Хранят в холодильнике.

Раствор яичного белка для реакций высаливания и ди­ализа. Белки трех куриных яиц отделяют от желтков и растворяют в 700 мл дистиллированной воды, к которой прибавляют 300 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3—4 слоя. Хранят в холодильнике.

Раствор молочных альбуминов. К 200 мл снятого мо­лока добавляют равный объем насыщенного раствора сер­нокислого аммония, перемешивают и оставляют на 10— 15 мин., после чего фильтруют через складчатый бумаж­ный фильтр. В растворе — альбумины, в осадке — глобу­лины и казеин.

Раствор растительных белков. К 40 г пшеничной муки прибавляют 160 мл дистиллированной воды, перемеши­вают и колбу переносят в холодильник (1—2° С) на сут­ки, затем снова перемешивают и фильтруют вначале че­рез гигроскопическую вату, а потом через складчатый бумажный фильтр. Раствор содержит главным образом альбумины. Хранят в холодильнике.

1 Массу дрожжей и объем серной кислоты можно соответственно увеличить.

2 Для этого клу­бень картофеля или часть кочана капусты натрите на терке из нержавеющей стали. Растертую массу отожмите через марлю, сложенную в два слоя.

37