Магистерская диссертация на тему "ВЛИЯНИЕ МАГНИТОМАРКИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК НАНОЧАСТИЦАМИ МАГНЕТИТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫМИ ПВС, НА ИХ ЖИЗНЕСПОПОСОБНОСТЬ"

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего образования

«Южный федеральный университет»

Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского

Севостьянова Ольга Викторовна

ВЛИЯНИЕ МАГНИТОМАРКИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК НАНОЧАСТИЦАМИ МАГНЕТИТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫМИ ПВС, НА ИХ ЖИЗНЕСПОПОСОБНОСТЬ

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

по направлению 020400– Биология

Научный руководитель

Профессор кафедры биофизики

ГОУ ВПО «Донецкий национальный университет», д.ф.-м.н.

Беспалова Светлана Владимировна

Рецензент

Профессор кафедры теоретической физики и нанотехнологий

ГОУ ВПО «Донецкий национальный университет», д.ф.-м.н.

Петренко Александр Григорьевич

Ростов-на-Дону – 2017

РЕФЕРАТ

Выпускная квалификационная работа магистерская диссертация: 45 с., 5 рис., 64 использованных источника.

Объект исследования – клетки дрожжей Saccharomyces Cerevisiae, маркированные магнитными наночастицами, стабилизированными поливиниловым спиртом.

Цель данной работы состояла в исследовании влияния магнитной маркировки с использованием наночастиц магнетита, стабилизированных поливиниловым спиртом, на жизнедеятельность дрожжевых клеток. -

В настоящей работе получены следующие результаты.

• Показано, что с помощью магнитных наночастиц, стабилизированных поливиниловым спиртом, можно магнитомаркировать дрожжевые клетки с сохранением их жизнеспособности.

• установлено, что магнитомаркирование дрожжевых клеток наночастицами с ПВС приводит к увеличению доли мертвых клеток в популяции, причем это увеличение пропорционально времени магнитной маркировки, следовательно, при исследованных условиях маркировки магнитные наночастицы, стабилизированные ПВС проявляют цитотоксичность по отношению к дрожжевым клеткам.

• С помощью теста «силы подкисления» показано, что после магнитной маркировки дрожжевых клеток наночастицами, стабилизированными ПВС, наблюдается снижение выхода протонов из клетки, что можно интерпретировать как ухудшение физиологического состояния маркированных клеток.

Результаты работы могут быть использованы для разработки эффективных методов магнитной маркировки магнитоуправляемых биосорбентов на основе дрожжевых клеток

НАНОЧАСТИЦЫ МАГНЕТИТА, МАГНИТОМАРКИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ, МАГНИТОФОРЕЗ.

ОГЛАВЛЕНИЕ

РЕФЕРАТ 2

ОГЛАВЛЕНИЕ 3

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1 Дрожжи как объект магнитной маркировки 8

1.1.1 Характеристика клеток дрожжей Saccharomyces сerevisiae 8

1.1.2 Дрожжи как модельная система 9

1.1.3 Магнитная маркировка клеток дрожжей 10

1.1.4 Оптимальная степень насыщения клеток магниточастицами 13

1.2 Магнетизм живой и неживой природы 13

1.2.1 Понятие диа- и парамагнетизма 13

1.2.2 Исследование магнитных свойств клеток 14

1.2.3 Магнитные наночастицы 15

1.2.4 Биологические эффекты при взаимодействии наночастиц с живыми организмами 16

1.3 Применение клеток, меченных магнитными наночастицами 17

1.3.1 Области применения магнитомаркированных клеток и магнитных наночастиц 17

1.3.2 Взаимодействие мембраны клетки с наночастицами 19

1.3.3 Цитотоксичность наночастиц 21

1.3.4 Водородный показатель рН и поверхностный заряд - важные показатели суспензии магнитомаркированных клеток 23

1.3.5 Получение МНЧ, стабилизированных ПВС, для магнитной маркировки клеток 24

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА 26

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 31

ВЫВОДЫ 38

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 39

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

МНЧ – магнитные наночастицы

ПВС – поливиниловый спирт

ВГМП – высокоградиентное магнитное поле

TEM – просвечивающая электронная микроскопия

ВВЕДЕНИЕ

В современном мире большое значение для человека имеют нанотехнологии. Проблемами использования наночастиц и модификации ими различных объектов занимается достаточно большое количество ученых, эта область исследований является относительно молодой. Магнитные наночастицы (МНЧ) и магнитомаркированные клетки в последние годы широко применяются в биомедицине и биотехнологиях [1-4]. В частности МНЧ используют для нахождения и разделения белков и клеток [5-7], олигонуклеотидов [8].

Большое внимание в современных исследованиях уделяется биотехнологиям с применением магнитомодифицированных клеток, которые получены с использованием МНЧ. Поэтому магнитная маркировка живых клеток с сохранением их жизнеспособности для дальнейшего использования является актуальной проблемой.

Магнитные носители используют для очистки крови при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. Клетки Т4 и Т8 у ВИЧ - инфицированных пациентов были отделены с применением магнитного разделения, это позволило изучить влияние различных лекарственных препаратов на специфические типы клеток [9]. Также магнитные наночастицы применяют для магнитомаркирования вирусных, бактериальных и других клеток. Существует достаточно много работ, которые описывают использование магнитных частиц для гипертермии, в этих исследованиях которых выявлен терапевтический эффект на нескольких типах опухолей [10, 11].

Многофункциональные магнитные наночастицы нашли широкое применение в биомедицине, физике, аналитической химии и других областях, но многие вопросы остаются не решеными.

Магнитные наночастицы обладают рядом свойств, которые связаны с проявлением квантово – размерных эффектов, таких как большой магнитокалорический эффект, суперпарамагнетизм, намагниченность и магнитная анизотропия, которыми можно управлять с помощью внешнего магнитного поля.

Магнитные наночастицы могут быть парамагнетиками, суперпарамагнетиками, в зависимости от свойств магнитного ядра, и могут содержать гадолиний, марганец или, чаще всего, оксид железа [12].

Цель данного исследования заключается в исследовании влияния магнитомаркирования клеток дрожжей наночастицами магнетита Fe₃O₄ стабилизированными поливиниловым спиртом на их жизнеспособность.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Дрожжи как объект магнитной маркировки 1.1.1 Характеристика клеток дрожжей Saccharomyces сerevisiae

В наших экспериментах были использованы пекарские дрожжи. Это достаточно примитивные аскомицеты, являющиеся представителями порядка эндомицетовых. Строение дрожжевой клетки приведено на рис. 1.1. Клетки дрожжей одноядерные, размножаются несколькими способами, но чаще всего почкованием, этот процесс происходит достаточно быстро (при благоприятных условиях). При почковании сначала появляется вырост на материнской клетке, затем происходит митотическое деление ядра, образование клеточной стенки и отделение клеток друг от друга. На материнской клетке остается шрам от почкования, что позволяет определить её возраст. Обычно материнская клетка может образовывать 20 – 30 почек.

Рисунок 1.1 – Схема строения дрожжевой клетки: 1 – клеточная оболочка; 2 – ядро; 3 – цитоплазма; 4 – вакуоль; 5 – митохондрии; 6 – рибосомы

Клетки дрожжей могут пребывать в одном из двух стабильных состояниях (фазах): гаплоидном (сфероиды) и диплоидном (эллипсоиды), которые считаются различными поколениями. В течение каждой фазы пекарские дрожжи размножаются вегетативно почкованием. По продолжительности у пекарских дрожжей преобладает диплоидная фаза. Она переходит в гаплоидную фазу путем образования гаплоидных аскоспор в результате мейоза. Гаплоидная фаза переходит в диплоидную путем слияния образовавшихся из аскоспор гаплоидных клеток [13].

Дрожжевые клетки обыкновенно одиночные, сферической или овальной формы. Размер дрожжевой клетки варьируется от 6 до 11 мкм, зависит от условий развития и вида дрожжей. Соотношение оболочки клетки к ее размеру оказывает большое влияние на темп массообменных действий меж клеточной средой и субстратом, таким образом, на активность жизнедеятельности дрожжей. Физиологическое состояние дрожжевых клеток можно определять по внешнему виду, путем окрашивания клетки. В производственных сферах имеются одновременно молодые, старые, зрелые, мертвые, почкующиеся клетки дрожжей. Наибольшую бродильную энергию содержат зрелые клетки, обладающие высокой устойчивостью.

Дрожжевая клетка снаружи имеет клеточную стенку, которая в сравнении с мембраной, обладает хорошей проницаемостью. Через мембрану же проходит пассивный и активный транспорт питательных веществ и ионов. Нативные дрожжи по своим магнитным свойствам являются диамагнетиками.

1.1.2 Дрожжи как модельная система

Клетки Saccharomyces сerevisiae являются модельными организмами, отражающими многие характеристики клеток млекопитающих, обеспечивая основные условия для задания токсичности и, таким образом, получения соответствующих данных для оценки риска для человека. Тем не менее, критически они гораздо более надежны, чем клетки млекопитающих, что дает в перспективе преимущества для дрожжевых клеток при создании биосенсоров на жизнеспособной клеточной основе. Они могут выдерживать изменение рН в широком диапазоне, могут выжить при температуре выше 40 C, и они обладают переносимостью к широкому спектру осмотических и электролитических условий.

Несколько видов дрожжей, особенно Saccharomyces сerevisiae, широко используются в генетике и клеточной биологии как модельный организм. Это в значительной степени происходит потому, что клеточный цикл и физиологические процессы клеток дрожжей очень схожи с соответствующими процессами в человеческих клетках, и поэтому основные клеточные механизмы репликация ДНК, рекомбинация, деление клетки и метаболизм имеют много общих черт. Также много белков, важных в биологии человека, впервые были обнаружены при изучении их гомологов в дрожжах; эти белки включают белки клеточного цикла, сигнальные белки и ферменты, модифицирующие белки. Данный тип клеток неоднократно выбирался для намагничивания учеными в своих экспериментах [14].

1.1.3 Магнитная маркировка клеток дрожжей

Как показывают исследования многих ученых, дрожжи могут быть намагничены без потери жизнеспособности [14]. Это дает возможность их модификации методами магнитомаркирования для различных применений. На данный момент магнитное мечение клеток и магнитный контроль клеточного движения используется при изучении клеточной механики [15], при магнитной сортировке клеток [16], в тканевой инженерии [17, 18] и других областях. На сегодняшний день активно разрабатываются магнитные наночастицы, которые предназначены для магнитной доставки клеток in vivo. Такие наночастицы представляют собой магнитоактивное ядро, окружённое оболочкой из различных биополимеров. Оболочка таких наночастиц выполняет ряд важных функций: предотвращает слипание ядер наночастиц, защищает магнитное ядро от окисления и эрозии, повышает их гидрофильность, обеспечивает проникновение наночастиц внутрь клеток путём эндоцитоза [19, 20]. Также в ряде работ [1, 15, 17] показано, что магнитная маркировка может быть применена к другим клеткам (в том числе бактериям, водорослям, растительным клеткам) c сохранением их жизнеспособности. Такая технология дает новые возможности многим другим видам клеток, для использования в медицинских, исследовательских и промышленных целях.

Многочисленными иследованиями установлено, что эффективность поглощения наночастиц клетками зависит как от типа клеток, так и от физико-химических параметров наночастиц, таких как размер, форма, поверхностный заряд и структура оболочки [21,22].

Магнитные наночастицы могут быть классифицированы как парамагнетики, суперпарамагнетики, в зависимости от свойств их магнитного ядра, и содержат чаще всего оксид железа [23].

Помимо искусственного магнитомаркирования в природе существует природная магниторецепция живых организмов, которая служит им ориентиром в пространстве по магнитному полю Земли.

Американские биологи Кейджи Нишида и Памела Сильвер (Pamela Silver and Keiji Nishida, 2012) проводили ряд исследований по магнитомаркированию дрожжей Saccharomyces сerevisiae, которые после модификаций стали чувствительными к магнитному полю. На первом этапе исследования Нишида и Сильвер растили дрожжи в среде с повышенным содержанием лимоннокислого железа. Выращенные таким образом Saccharomyces сerevisiae, которые обычно не чувствительны к магнитному полю, стали реагировать на силу и направление этого поля. Затем ученые "подправили" ДНК дрожжей, помимо маркирования добавили клеткам ген, отвечающий за выработку ферритина – белка, который используется для запасания железа у животных и человека. Модифицированные дрожжи оказались во много раз чувствительнее своих диких собратьев к магнитному полю. Они проявляли чувствительность к магнитному полю уже через две минуты после того, как их начинали кормить лимоннокислым железом (у обычных дрожжей чувствительность проявлялась через 10 минут).

Анализ внутреннего строения дрожжей позволил установить, что они запасают железо, связанное собственным белком, которое хранилось в вакуолях. В модифицированных грибках железо находилось прямо в цитоплазме клетки. Также исследователи говорят, что приобретение клетками магнитных свойств может помочь в создании технологий эффективной манипуляции ими.

На сегодняшний день известно, что большинство организмов являются однозначными диамагнетиками, в то время как обнаруживающие способности магнитотаксиса бактерии и мигрирующие животные являются теми из организмов, которые используют влияние магнетизма в своих целях. Стимулирующее (биогенное) воздействие намагничивания не только представляет фундаментальный интерес, но также и имеет технический потенциал. Однако, ключевым фактором, который делает возможным использовать биогенное намагничивание в координации с другими клеточными функциями и метаболизмом, остается неизвестный.

Магнитные взаимодействия, рассматриваемые в биологии, могут быть бесконтактными, дистанционными, и проникающими вглубь организма, наличие магнитных свойств в биологических системах обеспечивает новые возможности для биоинженерии и терапии. Магнитные функции могут обеспечить уникальные поверхностные контакты между клетками, например, исходная магнитная чувствительность и конечное индуцированное намагничивание дает возможность не только магнитной манипуляции, но и магнитометрического считывания результатов как в случае магнитно-резонансной томографии (МРТ). Только некоторые из природных систем, как известно, наделены магнитной функцией. Ориентирующиеся в магнитном поле бактерии синтезируют цепь органелл называемые магнетосомами [24], в которых возможен синтез ферромагнитных частиц магнетита (Fe₃O₄) или грейгита (Fe₃S₄) (обзор в [25]). Клетки, имеющие возможность ориентироваться и двигаться вдоль силовых линий геомагнитного поля, находятся в лучших условия роста, что более эффективно, чем при случайном плавании (обзор в [26]). В геномах этих видов бактерий, определенные кластеры генов, называемые магнетосомными генными островками, сохраняются.

1.1.4 Оптимальная степень насыщения клеток магниточастицами

Не до конца изученным вопросом является определение оптимальной степени насыщения клеток магниточастицами. Насыщение должно быть достаточным для магнитного управления их движением in vivo, но без нарушения при этом жизненных функций клетки. Оптимальная степень насыщения клетки зависит от ее физиологического состояния, особенностью метаболических процессов, а также от размера магнитного ядра и протекторных свойств оболочки магниточастиц. Для получения требуемого насыщения определённого типа клеток определёнными магниточастицами подбирают, в настоящее время чаще всего эмпирически, такие параметры как концентрация магниточастиц в растворе, время инкубации, воздействие дополнительных физических (градиентное магнитное поле, ультразвук и др.) или химических (трансфекционные агенты) факторов. Для оценки магнитной управляемости насыщенных магниточастицами клеток осуществляют различные магнитофоретические опыты in vitro, суть которых заключается в захвате магнито-меченных клеток высокоградиентным магнитным (ВГМ) полем в статических или проточных условиях [27].

1.2 Магнетизм живой и неживой природы 1.2.1 Понятие диа- и парамагнетизма

Вещества, которые во внешнем магнитном поле способны приобретать магнитные свойства называются магнетиками. О существовании магнитных токов в любом теле свидетельствует явление намагничивания, которое полностью связано с наличием у атомов микроскопических магнитных моментов.

От того как ведут себя вещества во внешнем магнитном поле, их классифицируют на две группы – это парамагнетики и диамагнетики.

Диамагнетиком является любое вещество, это значит, что оно под действием магнитного поля приобретает магнитный момент (намагничивается). При отсутствии внешнего магнитного поля диамагнетики немагнитные, это объясняется тем, что магнитные моменты электронов полностью компенсируются. Диамагнетическая намагниченность слабо зависит от температуры. Высоким диамагнетизмом обладают неорганические вещества, такие как золото, хлор, натрий, алмаз, каменная соль, водород и углекислый газ.

Парамагнетиками являются вещества, которые намагничиваются по направлению магнитного поля и втягиваются в него, но они обладают достаточно слабой намагниченностью. Сильно магнитные вещества и элементы с постоянной спонтанной намагниченностью называются ферромагнетиками. Намагниченность их резко возрастает даже в очень слабых магнитных полях. Внешнее магнитное поле обеспечивает высокую степень ориентации элементарных моментов атомов.

Ферромагнитными свойствами обладают кобальт, железо, никель, уран. При низких температурах – тулий, тербий, гольмий. Максимальная магнитная индукция ферритов намного ниже, нежели у металлических ферромагнетиков, составляет 0.3 – 0.4 Т (против 0.8 – 2.5 Т для металлов). Наиболее известным соединением из группы ферритов является магнетит – Fe₃O_4.

1.2.2 Исследование магнитных свойств клеток

Исследование индивидуальных магнитных свойств функционирующих биологических клеток, клеточных фрагментов и органелл, а также их модельных аналогов типа бислойных агрегатов лиотропных мезофаз, представляется весьма нужным и интересным [28]. Интерес этот обусловлен естественным стремлением к расширению области физических исследований на заведомо неравновесный объект, чье состояние во многом определяется не только такими параметрами как температура и давление, но и составом и состоянием необходимой для его функционирования окружающей буферной среды. Немаловажным условием продвижения в этом направлении является выбор или искусственное создание простейшего объекта, умение измерять его свойства, в частности и магнитные, без нарушения целостности объекта и его внутренних связей. К этому можно добавить, что понимание опережающих и интенсивно развивающихся исследований по влиянию магнитных полей на клетки, ткани и организмы невозможно без знания материальных констант молекулярных и надмолекулярных структур клетки, в частности их статических и динамических магнитных восприимчивостей [29].

Исследования магнитных свойств биологических микрообъектов предъявляют ряд требований к технике и методике измерений. Так, исследуемый объект требует для поддержания своего функционального состояния и соответствующего проявления своих специфических свойств определенного окружения — буферной среды, магнитной восприимчивости которая близка к восприимчивости самого объекта. Кроме того, часто необходимо выделить вклад от какой-либо части объекта, составляющей несколько процентов от его массы или объема.

1.2.3 Магнитные наночастицы

Для изменения магнитных свойств живых клеток, то есть их магнитной модификации, используют магнитные наночастицы. Поэтому рассмотрим понятие и некоторые свойства наночастиц.

Наночастицы представляют собой гигантские псевдомолекулы имеющие сложное внутреннее строение, в основном ядро и оболочку, и внешние функциональные группы и т.п. Их магнитные свойства возникают при размерах 2-30 нм. Ограничение по размерам связано с тем, что наночастицы, будучи, как всякие частицы, частью целого, при достижении некоторых размеров начинают резко отличаться от породившего их целого; оценки показывают, что существенные различия начинают возникать, как правило, при размерах частиц ниже 30 нм. Для магнитных наночастиц это значение по порядку величины совпадает с теоретически оцененными наименьшими размерами магнитного домена для большинства магнитных материалов.

Наночастицы и наноматериалы обладают комплексом физических, химических свойств и биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств тех же веществ в форме сплошных сред или дисперсий частиц микронного и более крупного размера [30]. Наночастицы имеют размер от 1 до 900 нм. В связи с этим, в группу наночастиц относят разнородные по химическому строению и физическим свойствам частицы [31].

Деление наночастиц возможно на органические и неорганические. Физико-химические свойства наночастиц предопределяют их назначение в наномедицине.

В наших экспериментах проводились опыты с суперпарамагнитными частицами оксида железа. Данные частицы чаще всего используют в биомедицинских целях. Благодаря малым размерам, наночастицы способны свободно приближаться к биообъекту и взаимодействовать, связываясь с ним. [32].

1.2.4 Биологические эффекты при взаимодействии наночастиц с живыми организмами

В работе [33] для изучения взаимодействия дрожжевых клеток Saccharomyces сerevisiae с магнитными наночастицами хлебопекарские дрожжи инкубировали с магнитной жидкостью на основе магнетита, стабилизированной хлорной кислотой и имеющей низкий рН, и нагревали либо до инкубации с магнетитом, либо после нее. В результате получали различные картины взаимодействия при наблюдении методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии [34].

Если клетки нагревали перед инкубацией с магнитной жидкостью, частицы Fe₃O₄ поглощались клетками в очень малом количестве, а большое их количество обнаруживалось на поверхности клеток, что обусловливало их агломерацию и шероховатость клеточной поверхности. Если клетки сначала инкубировали с магнитной жидкостью, затем нагревали, то на микрофотографиях, полученных методом сканирующей электронной микроскопии, наблюдали гладкую клеточную поверхность, а изображения, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии, указывали на присутствие незначительного количества магнитных наночастиц на клеточной поверхности и огромного их количества – внутри клеток, причем большинство наночастиц было обнаружено в периплазматическом пространстве (между клеточной стенкой и плазматической мембраной), и малое количество наночастиц находилось в цитоплазме. Полученные результаты указывают на то, что поглощение клетками магнитных наночастиц – активный, а не пассивный процесс. При нагревании клеток в температурном режиме, оптимальном для их размножения, сначала количество клеток не возрастает (латентная фаза), затем резко увеличивается (экспоненциальная фаза роста), при этом происходит ускорение клеточных функций, включая способность к эндоцитозу. В процессе эндоцитоза магнитные наночастицы способны проникать в большом количестве через клеточную стенку, но не плазматическую мембрану, которая обладает большей селективностью [35].

1.3 Применение клеток, меченных магнитными наночастицами 1.3.1 Области применения магнитомаркированных клеток и магнитных наночастиц

В настоящее время интенсивно развиваются несколько областей применения магнитомодифицированных клеток. Магнитная маркировка стволовых клеток применяется в медицине для повышения их терапевтической эффективности путем магнитуправляемой доставки и магнитного удержания в местах необходимой локализации в организме [18-22]. Также увеличивается количество исследований, связанных с применением магнитомаркированных клеток как эффективных магнитоуправляемых биосорбентов [30] и биокатализаторов [31].

Магнитные наночастицы также имеют широкий спектр применения: разделение клеточных смесей, выделение антител из гибридных культур клеток, получение иммунодиагностических препаратов, выделения фагоцитов человека и животных, иммобилизации ферментов, избирательного контрастирования клеток и молекулярных структур при электронной микроскопии, определения жизнеспособности и активности клеток и других диагностических тестов, моделирования заболеваний, например иммунодефицитного состояния, гепато- и нефропатии, а также для исследования внутриклеточных процессов. Используются коллоидные частицы магнетита с высокой электронной плотностью, которые управляются магнитным полем, легко проникают в малые кровеносные сосуды и живые клетки (соизмеримы с белковыми глобулами и толщиной мембраны). В биологии и медицине используются различные типы коллоидных магнитных частиц и способы их применения, включая сочетание с воздействием постоянных магнитных полей, ВЧ- и СВЧ-излучений, ультразвука [36]. Магнитное мечение гладкомышечных клеток наночастицами магнетита позволяет находить клетки методом магниторезонансного получения изображений (MPT) после их локальной трансплантации в сердце. Жизнеспособность гладкомышечных клеток после магнитного мечения не уменьшается. Меченые магнитными наночастицами стволовые эндотелиальные клетки, которые приводятся в движение магнитным полем, способны достигать места повреждения кровеносных сосудов и сердца, накапливаться в зоне повреждения, в 5 раз большем, чем контрольные немеченые клетки [37]. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга способны внедряться в некоторые опухоли и метастазы, для уменьшения массы опухолей на моделях глиомы, рака молочной железы, меланомы и колоректальной опухоли мышей, что приводит к продлению их жизни. При рассмотрении клеток методом магниторезонансной томографии установлено, что свободные частицы железа и меченые железом умершие клетки не реагируют на MРТ, что объясняется выведением железа из организма, и только живые, меченые железом клетки откликались на сигнал магнитного резонанса [38]. Малые суперпарамагнитные частицы оксида железа использовались учеными в качестве контрастирующего агента для MРТ. Поглощение железа посредством эндоцитоза человеческими мезенхимальными стволовыми клетками подтверждались гистологическими исследованиями при окрашивании прусским голубым и количественно определялось методом масс-спектрометрии. По сравнению с немечеными клетками меченые очень малые суперпарамагнитные частицы оксида железа не влияют на жизнеспособность. Также показано, что включение в человеческие мезенхимальные стволовые клетки железа не помешало нормальному прохождению их дифференциации.

1.3.2 Взаимодействие мембраны клетки с наночастицами

Взаимодействие наночастиц с клетками и липидными бислоями имеет важное значение в различных областях применения, например, в фототерапии, визуализации, и доставки лекарств или генов. Такое применение модифицированных клеток является предметом тщательного наблюдения, т.к. взаимодействие наночастиц и клеток, определяется поверхностным свойством наночастиц.

Плазматическая мембрана обладает избирательной проницаемостью, является границей и поддерживает необходимую внутриклеточную среду клетки. Малые и неполярные молекулы, такие как O₂ и CO₂, могут легко проникать через липидный бислой, однако полярные молекулы, такие как ионы и более крупные наноматериалы, неспособны самостоятельно проникнуть через плазматическую мембрану. В природе важные ионы и белки нанометрового размера транспортируются сквозь липидный бислой через специализированные мембранно-транспортные белковые каналы [39].

Большинство других наномасштабных макромолекул и молекулярных агрегатов впитываются посредством эндоцитоза (процесс захвата макромолекул в клетки путем помещения их в мембранные везикулы, при контакте с клеточной мембраной. Эти эндоцитозированные наноматериалы заключены в эндолисозомы (связанные с мембраной везикулы) и неспособны достичь цитозоля [39].

Эндоцитоз, например, наночастицы золота размером 3.4 нм поглощается клеткой макрофагов с помощью механизма, включающего пиноцитоз, как показано измерениями атомной силовой микроскопии (АСМ) [40]. Результаты исследования просвечивающей электронной микроскопии (TEM) подтвердили, что через 24 часа после взаимодействия с поверхностью клетки наночастицы находятся в лизосомальных телах, упорядоченных перинуклеарным способом. Эндоцитоз не ограничивается наночастицами золота, но также наблюдается для наночастиц оксида железа [41-43].

Наблюдения ученых показывают, что в большинстве случаев наноматериалы содержатся в везикулярных структурах и не могут нарушать барьеры клеточной мембраны, кинетика, количество и механизм поглощения варьируют в зависимости от многих факторов в исследовании, таких как чистота наноматериала, условия инкубации наноматериал-клетка, обработки клеток, типа клетки и типа наноматериала. Многие применения, которые задуманы для синтетических и биологических наноматериалов, требуют повреждения барьеров клеточной мембраны для достижения цитозольного механизма или ядра клетки.

Проницаемость клеточных мембран по своей природе является сложным процессом из-за природы липидного бислоя и, защиты клетки Многие наноматериалы, тем не менее, способны проходить через клеточные мембраны. [44-46].

Учеными было обнаружено, что форма и размер наночастиц влияют на их клеточное поглощение [47, 48].

Обнаружено также, что кинетика поглощения и концентрация насыщения изменялась с помощью дифференцированных наночастиц с размером 50 нм, которые наиболее эффективнее поглощаются клеткой, что указывает на то, что это может быть оптимальный размер для эффективного поглощения наноматериалов в клетках [49].

Изучение влияния формы и размера наноматериалов на клетки имеет важное значение, поскольку это может иметь большое значение для токсичности [50].

1.3.3 Цитотоксичность наночастиц

Токсическое воздействие наноразмерных частиц на клетки обусловливается их высокой реакционной способностью, эффективной диффузией сквозь биологические мембраны и преодолением тканевых барьеров [51]. Наночастицы с сильными окислительными (CeO₂, Mn₃O₄, Co₃O₄) или восстановительными (Fe⁰, Fe₃O₄, Ag⁰, Cu⁰) свойствами могут быть цитотоксичными и генотоксичными по отношению к биологическим мишеням в условиях in vitro. Один из основных источников токсичности – электронный и/или ионный перенос, происходящий в процессе окисления-восстановления, растворения и каталитических реакций либо внутри кристаллической решетки наночастиц, либо при выходе в культуральную жидкость. Другие механизмы токсичности заключаются в разрыве целостности мембраны или нарушении нативных цепей транспорта ионов и электронов после адсорбции наночастиц на основе железа на клеточной стенке бактерий. В клетках, подвергнутых воздействию суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, ослабевают функции митохондрий, происходят воспалительные процессы, апоптоз, утечка биологически активных молекул сквозь клеточную мембрану, генерация реакционно активных форм кислорода, увеличение количества микроядер (что свидетельствует о повреждении хромосом и является показателем генотоксичности), а также конденсация хромосом [52]. Реакционно активные формы кислорода, такие как супероксид-анион О^2-, гидроксил-радикал, синглетный кислород, при взаимодействии с компонентами ДНК приводят к нарушению их структуры. Инъекция до 5 мг наночастиц Fe₃O₄ внутрь мозга крыс не приводит к необратимым нарушениям его жизненно важных функций. Как показали исследования разрыва клеток [53] по измерению выхода из них лактатдегидрогеназы, образования оксида азота (V) и индукции апоптоза, наночастицы гематита крупнее 90 нм не оказывают видимых признаков токсичности на альвеолярные макрофаги мыши и эпителиальные клетки легких человека. Наночастицы гематита не приводят к повреждению ДНК в клетках А549 после выдержки в течение 4 ч при концентрации наночастиц 20 – 40 мкг/см², в то время как инкубация в течение 24 ч с наночастицами в концентрациях 10 и 50 мкг/см² способствует возникновению разрывов ДНК, о чем свидетельствуют результаты электрофореза в геле фрагментов ДНК. Уменьшение размера частиц может приводить к их токсическому воздействию на клетки. Оксиды железа обладают слабой цитотоксичностью, отчетливых различий при воздействии на клетки частиц различных размеров не наблюдается (в отличие от оксида меди СuО, наночастицы которого были гораздо более цитотоксичными по сравнению с микрочастицами). Микрочастицы Fe₂O₃ и TiO₂ обладают значительно большей токсичностью по отношению к клеточной ДНК, чем наночастицы той же концентрации. Активность митохондрий определяли по деполяризации митохондриальных мембран при окрашивании катионным липофильным флуоресцентным красителем (этиловым эфиром тетраметилродамина). Если внутренний мембранный потенциал утрачен, флуоресценция не наблюдается [53]. Вдыхание пыли, содержащей магнетит, оказывает токсическое воздействие на ДНК эпителиальных клеток легких человека. Исследовали [54] четыре фракции магнетита: сыпучий материал (0.2 – 10 мкм), вдыхаемую фракцию (2 – 3 мкм), альвеолярную фракцию (0.5 – 1.0 мкм) и наночастицы (20 – 60 нм). Изучали поглощение магнетита клетками после выдержки в течение 24 ч. Снимки, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии, свидетельствуют о включении частиц магнетита в клетки А549 посредством эндоцитоза. Частицы находятся в виде агломератов в связанных с цитоплазмой везикулах, немного частиц – в цитоплазме и совсем не обнаруживаются в ядре. Для всех изучаемых фракций, после выдержки в течение 24 ч, наблюдается увеличение образования реакционно активных форм кислорода, определяемых с применением 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетата, которые могут приводить к значительному разрушающему воздействию на гены клеток. Обработка макрофагов N-ацетил-L-цистеином или Trolox™ (два различающихся по механизму действия антиоксиданта) препятствует запуску процессов апоптоза и возникновению цитотоксических эффектов [54].

1.3.4 Водородный показатель рН и поверхностный заряд - важные показатели суспензии магнитомаркированных клеток

Одно из важнейших свойств водных растворов – их кислотность (или щелочность), которая определяется концентрацией ионов Н⁺ и ОН^-. Значения рН играют большую роль в жизнедеятельности живых организмов. Биохимические процессы в организмах протекают при определенной кислотности. Многие процессы, происходящие в организме, осуществляются благодаря наличию биологических катализаторов, которые могут работать только в определенных значениях рН. Например, работа фермента пепсина, который катализирует гидролиз белков, способствуя перевариванию белковой пищи в желудке, при максимальных значениях рН около 2. Таким образом, для нормального пищеварения нужно, чтобы желудочный сок имел значения рН от 1.53 до 1.67.

В клетках живых организмов значение рН равняется 7, во внеклеточной жидкости – 7.4. Нервные окончания, находящиеся вне клеток, чувствительны к изменению рН.

Особенно важно значение рН крови, оно должно находиться в строго определенных пределах, т.к. при небольшом подкислении (ацидоз) или защелачивании (алкалоз) может произойти гибель организма. Алкалоз наблюдается при гипервентиляции легких (или при вдыхании чистого кислорода), при анемии, отравлении СО, опухоли мозга, избыточном потреблении питьевой соды или щелочных минеральных вод.

Микроорганизмы так же как и организм человека очень чувствительны к значениям рН. Патогенные микробы, например, развиваются быстрее в слабощелочной среде, а кислую среду, не выдерживают. Большое значение имеет правильный подбор рН и для химико-технологических процессов.

Значительные изменения pH любых биологических систем и особенно крови могут привести к гибели всего организма. Поэтому понятна огромная важность для организма поддержания pH в заданных природой пределах.

Концентрация водородных ионов играет большую, часто определяющую, роль в самых разнообразных явлениях и процессах – и природе и в технике. Особенно важна роль рН в жизнедеятельности растений и животных. Наш организм нормально функционирует только тогда, когда и в крови, и в тканевой жидкости различных органов поддерживается определённое соотношение ионов H⁺ и OH^-. Только при таких условиях в организме протекают процессы необходимые для нормальной жизнедеятельности [55].

Для электростатической стабилизации магнитных наночастиц, необходимо высокое значение дзета-потенциала. Дзета-потенциал – это электрический потенциал между краями диффузного слоя ионов в жидкости, окружающей заряженную коллоидную частицу, который возникает в результате накопления электрических зарядов на границе раздела твердой и жидкой фаз [56]. Дзета-потенциал зависит от концентрации электролита, растворенного в среде in vitro или белков плазмы, дополнительно адсорбировавшихся на наночастице in vivo. Если дзета- потенциал меньше, чем заданное критическое значение для конкретной системы, агрегация и осаждение частиц неизбежны. Поверхностный заряд также играет важную роль во время эндоцитоза, например, в меньшей степени поглощаются отрицательно заряженные частицы из-за отталкивания от одноименно заряженной клеточной мембраны. Тем не менее, эндоцитоз in vitro минимален, если дзета-потенциал близок к нулю [56]. В отличие от него, фагоцитоз увеличивается с более высоким поверхностным зарядом независимо от знака заряда. Чем выше поверхностный заряд, тем короче время пребывания частиц в кровеносной системе.

1.3.5 Получение МНЧ, стабилизированных ПВС, для магнитной маркировки клеток

Так как в наших исследованиях для магнитной маркировки дрожжевых клеток применялись наночастицы, стабилизованные поливиниловым спиртом, полученные по технологии аналогичной технологии, описанной в работе [57], кратко рассмотрим особенности этого процесса. В [57] описано, что синтез полимерного нанокомпозита на основе Fe₃O₄ и поливинилового спирта (ПВС) проводили методом химического соосаждения. В качестве носителя металла выступали хлориды железа FeCl₃6H₂O и FeCl₂4H₂O, взятые в стехиометрическом соотношении 2:1. Прекурсоры получали добавлением солей металла к раствору ПВС в деионизированной воде. Отношение массы чистого железа в смеси к массе полимера варьировали от 30 до 60 %, а массы ПВС к массе воды – от 3 до 10 %. Восстановительной средой при синтезе служили водные растворы аммиака или едкого натра (взятые по отношению к воде в пропорции 1:4). Приготовление композита осуществляли следующим образом: длительным высушиванием при температуре 50-343 К из раствора удаляли растворитель до получения твердого остатка прекурсора, который затем заливали в избытке водным раствором NH₄OH или NаOH и выдерживали так от 1 до 48 ч. Средний размер частиц, для полученных композитов варьировался от 15 до 45 нм [57].

Таким образом, из приведенного обзора литературы видно, что процессы взаимодействия МНЧ, стабилизированными разными покрытиями, с поверхностью живых клеток являются сложными, влияние МНЧ на физиологическое состояние маркированных клеток – неоднозначно, поэтому исследования, связанные с влиянием магнитной маркировки на жизнеспособность клеток, - актуальны.

В настоящей работе были поставлены следующие задачи.

- Исследование влияния времени магнитомаркирования клеток дрожжей в коллоидном растворе наночастиц, стабилизрованных ПВС, на соотношение мертвых и живых клеток в их популяции.

- Исследование влияния времени магнитомаркирования клеток дрожжей в коллоидном растворе наночастиц, стабилизированных ПВС, на внеклеточное подкисление дрожжевой суспензии.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Методики проведения опытов.

В нашей работе мы подвергали магнитомаркированию клетки дрожжей Saccharomyces Сerevisiae ТМ «Pаkmаyа» с помощью магнитных наночастиц Fe₃O₄, стабилизированных поливиниловым спиртом (ПВС). Процесс магнитомаркирования клеток дрожжей проводили при добавлении в исходную суспензию дрожжей заданного количества коллоида МНЧ, стабилизированного ПВС, с последующим перемешиванием на магнитной мешалке ММ-5 в течении заданного времени экспозиции.

Для оценки влияния магнитомаркирования на процессы жизнедеятельности дрожжей проводили тест «силы подкисления». Для этого после заданного времени экспозиции клеток с наночастицами отбирали дрожжи из культивируемой среды, трижды отмывали дистиллированной водой и центрифугировали 2 минуты при N=3000 об./мин. После удаления надосадочной жидкости в оставшийся осадок добавляли 20 мл дистилированной воды и ставили на магнитную мешалку. Затем приступали к измерению внеклеточного рН в подготовленном образце в течении 10 минут. После ежеминутного снятия показаний рН, через 10 мин. добавили в исследуемую пробу 5 мл 20 %-го раствора глюкозы и перемешивали еще 10 минут, также поминутно записывая показания рН. Значения внеклеточной рН определяли с помощью мультипараметрового прибора ULAB МР 551. По полученным данным строили зависимости рН(t) и вычисляли значение ∆pH по следующей формуле 1:

∆рН = рН0 – рН20

(1)

где рН₀ – показания рН теста после первой минуты измерения;

рН₂₀ – конечное показание рН теста (по истечению 20 минуты).

Полученной значение ∆рН и являлось характеристикой, по которой мы оценивали метаболическую активность дрожжевой суспензии.

Для оценки выживаемости дрожжевой культуры после магнитомакирования использовали количественный микроскопический метод окрашивания водным раствором метиленового синего в камере Горяева. При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и эту смесь тщательно размешивают. Окраска живых дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, которые в водном растворе метиленового синего окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными.

Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми и окрашены в синий цвет.

Из полученных растворов чистой суспензии дрожжей и магнитомаркированных клеток брали по две капли. Перед тем как производить подсчет клеток, камеру и покровное стекло протирали насухо марлей, так как при протирке ватными тампонами остаются на стекле волокна, которые мешают подсчету клеток. Далее аккуратно притирали покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. При увеличении (окуляр ×20, объектив ×40) посчитывали дрожжевые клетки в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых (т.е. в 80 малых квадратах). Считали клетки в квадратах, расположенных по диагонали. Расчет концентрации живых и мертвых клеток в суспензии осуществлялся, по формуле 2:

Х= количество клеток над большим квадратом * 2,5·105,

(2)

где Х – число клеток в 1 мкл раствора.

Для каждого опыта каждый раз готовилась новая суспензия дрожжей.

Все эксперименты выполняли в трёх повторениях. Для сравнения в качестве контроля использовали маточную суспензию, которая развивалась без добавления наночастиц. При построении зависимостей использовали усредненные данные для трех повторений. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе MS Excel.

Исследования проводились в лаборатории биологического факультета ДонНУ.

Магнитомаркирование клеток дрожжей проводили при трех временах экспозиции 30, 60 и 90 минут с одинаковой концентрацией магнитных наночастиц.

Использованное оборудование

Центрифуга: Применялась для разделения маркированных клеток от надосадочной жидкости с магнитными наночастицами методом осаждения. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли.

Центрифуга обеспечивает регулирование частоты вращения ротора ступенчато в диапазоне от 1000 до 8000 об./мин., через каждые 1000 об./мин. и имеет 60-минутный механизм отсчета времени. Центрифуга комплектуется угловым ротором РУ 12х10 или РУ 8х10, вмещающим до 12 центрифужных пробирок (10мл). Ротор хорошо сбалансирован, так что лаборанту достаточно заполнять пробирки "на глаз", не уравновешивая пробы.

Условия эксплуатации центрифуги:

• температура окружающего воздуха от + 10 до +35 °С;

• верхнее значение относительной влажности воздуха 80 % при +25 °С.

Камера Горяева использовалась для подсчета количества клеток в пробе. Это прозрачный параллелепипед (предметное стекло), с бороздами и нанесённой микроскопической сеткой. Размеры малых делений клетки сетки составляют 0.05 мм, а больших — 0.2 мм. При этом сетка нанесена на площадку (участок стекла), расположенный на 0.1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0.004 микролитра. Подсчитав количество клеток над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии.

Микроскоп: подсчет клеток дрожжей осуществлялся на микроскопе МКД-Р при увеличении (окуляр ×15, объектив ×40) микроскопной системы. Для наблюдения за захватом клеток дрожжей в магнитном поле на магнитный концентратор необходим был микроскоп с большим рабочим расстоянием. Под рабочим расстоянием микроскопа принято понимать расстояние от предметного стола до объектива. Для этих исследований применялся микроскоп МКД-Р. При работе с объективом F25 рабочее расстояние составляет 60 мм, что позволяет разместить на предметном столе магнитную систему с образцами.

Микроскоп МКД-Р позволяет производить наблюдение в проходящем и отраженном свете, в светлом и темном поле.

Магнитная мешалка: предназначена для перемешивания и подогрева жидкостей в химических лабораториях и научно-исследовательских институтах. Действие мешалки основано на передаче движения от вращающегося магнита к перемешивающему стержню с помощью магнитного поля магнита. Жидкость перемешивается вращением магнитного стержня, помещаемого в сосуд с жидкостью, который устанавливается на кожухе мешалки.

Оксиметр лабораторный МР-551. Он предназначен для измерения рН, ЕРС, ЕПР, ТDS, соленость воды, массовой концентрации кислорода в воде и температуры жидкости. Прибор дополнительно укомплектован ион-селективными электродами и работает, как иономер. Имеется возможность определения концентрации таких ионов: Са²⁺, Сl^-, F^-, Br^-, Nа⁺. Точность: рН: ± 0.002рН; mV: ±0.03 %, Ion: ±0.5 % (одновалентные); ±1.0 % (двухвалентные), проводимость: ±0.5 %, DO: ±0.1мг/л.

Описание эксперимента

Раствор исходной суспензии дрожжей готовился следующим образом: в 50 мл воды, добавляли 1 г хлебопекарных дрожжей. Количество хлебопекарных дрожжей отмерялось с помощью аналитических весов. Количество воды определялось с помощью мерной колбы. Затем суспензию дрожжей осаждали центрифугированием (3000 об./мин.), отмывали три раза дистиллированной водой. В осажденные отмытые клетки дрожжей добавляли 50 мл дистиллированной воды.

Для проведения теста «силы подкисления» брали 20 мл суспензии дрожжей, помещали в стаканчик, в который опускали рН-электрод. Ежеминутно снимались показания рН, через 10 минут добавляли в исследуемую пробу 5 мл 20 % раствора глюкозы и перемешивали еще 10 минут, продолжая поминутно снимать показания рН.

Для получения магнитомаркированных клеток дрожжей отбирали 30 мл раствора, в него добавляли 9 мл коллоидного раствора магнитных наночастиц, стабилизированных поливиниловым спиртом, и перемешивали на магнитной мешалке 30, 60 и 90 минут при комнатной температуре 20С. После взаимодействия клеток дрожжей с магнитными наночастицами магнетита в течении заданного времени, клетки дрожжей отмывали три раза. Затем в отмытые магнитомаркированные клетки добавляли 50 мл дистиллированной воды, из полученного раствора отбирали 20 мл для проведения теста «силы подкисления» таким же способом, как и для контрольной суспензии дрожжей.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведения экспериментов по магнитному маркированию клеток дрожжей Saccharomyces сerevisiae при их экспозиции в течение 30, 60 и 90 минут в растворе, содержащем магнитные частицы Fe₃O₄, стабилизированные поливиниловым спиртом (ПВС) были получены суспензии дрожжей, которые реагировали на приложение магнитного поля. Необходимо отметить, что после магнитной маркировки клетки дрожжей приобрели темную окраску. Интенсивность потемнения увеличивалась при увеличении времени экспозиции. Так как частицы магнетита в оболочке ПВС имеют темную окраску, следовательно, в результате магнитной маркировки клетки дрожжей захватили некоторое количество наночастиц, достаточное чтобы изменить их окраску и магнитные свойства.

Одним из применений магнитомаркированных дрожжей является их использование в качестве биосорбентов [58, 59]. При этом установлено, что живые клетки обладают более высокой сорбционной способностью [60], поэтому важно, чтобы после магнитной маркировки дрожжи сохраняли свою жизнеспособность. Для оценки того как захваченные наночастицы повлияли на жизнеспособность дрожжей в настоящей работе провели подсчет соотношения живых и мертвых клеток в популяции после магнитного маркирования и отмывания клеток от остатков коллоида МНЧ для всех времен экспозиции, а также в контрольной популяции. Количество живых и мертвых клеток в популяции определяли методом их окрашивания водным раствором метиленового синего в камере Горяева. Так как после процедур маркирования и отмывания концентрация клеток в суспензиях изменилась, то сопоставление данных для разных экспозиций проводили по параметру А, который представляет собой отношение количества мертвых клеток N_м к количеству живых N_ж в данной суспензии.

Результаты сравнения параметра А для всех времен экспозиции и контрольной популяции представлены на рисунке 3.1. Из анализа рисунка 3.1 видно, что с увеличением времени экспозиции количество мертвых клеток в популяции по отношению к живым монотонно возрастает, что свидетельствует о повреждающем действии магнитных наночастиц покрытых оболочкой ПВС на дрожжевые клетки. При этом необходимо отметить, что после магнитной маркировки даже при времени экспозиции 90 минут живыми остаются порядка 50 процентов клеток в популяции, а при времени экспозиции 30 минут живыми остаются около 80 процентов клеток. Механизмы токсичного действия наночастиц на клетки в настоящее время еще активно исследуются и обсуждаются в научной литературе. Возможными причинами токсичности МНЧ называют повреждение клеточной мембраны и нарушение транспортных путей ионов и электронов после захвата МНЧ поверхностью клетки [61].

Рисунок 3.1 – Зависимость отношения мертвых клеток к живым от времени экспозиции

Для оценки влияния магнитной маркировки дрожжевых клеток магнитными наночастицами, стабилизированными ПВС, на их физиологическое состояние и процессы метаболизма в настоящей работе использовали тест «силы подкисления» [62], который отражает способность дрожжевых клеток экструдировать (выдавливать, выталкивать) протоны из внутреннего пространства клетки во внешнюю среду. Протоны могут накапливаться в клетке в результате переработки эндогенных источников энергии и экзогенной глюкозы. Тест «силы подкисления» во многих исследованиях [63, 64] применяется для оценки влияния различных стрессовых факторов, таких как осмотическое давление, температура, консерванты, голод и другие на ферментативную активность и способность дрожжевых клеток перерабатывать такой субстрат как глюкоза.

В результате проведения тестов подкисления для суспензий дрожжей, маркированных при различных временах экспозиции, получены кривые подкисления, показывающие изменение внеклеточной рН при помещении суспензии дрожжей в дистиллированную воду (первый этап теста подкисления, то есть спонтанное подкисление) и после добавления глюкозы (второй этап теста подкисления, то есть индуцированное подкисление). На рисунке 3.2, в качестве примера, приведено сопоставление кривых подкисления для контрольной суспензии не маркированных клеток и суспензии клеток, маркированных наночастицами при времени экспозиции 90 минут.

Рисунок 3.2 – Зависимости внеклеточной кислотности для контрольной суспензии клеток дрожжей и суспензии магнитомаркированных клеток после 90 минут экспозиции.

Из анализа рисунка 3.2 видно, что даже после 90 минут магнитной маркировки наночастицами с покрытием из ПВС в суспензии маркированных дрожжевых клеток наблюдается и спонтанная и индуцированная внешней глюкозой экструзия протонов, что свидетельствует о сохранении жизнеспособности клеток. Правда необходимо отметить, что величина падения ΔрН, рассчитанная по формуле (1) и скорость падения на этапе индуцированного подкисления после добавления экзогенной глюкозы для суспензии магнитомаркированных клеток стали меньше, что свидетельствует о некотором ухудшении метаболизма магнитомаркированных клеток. Например, для данных, приведенных на рисунке 3.2, общее падение водородного показателя рН контрольной суспензии составило ΔрН_к=1,40, а для суспензии, маркированной при времени экспозиции 90 минут, общее падение водородного показателя рН составило ΔрН_м90=1,16. Для дальнейшего анализа данных был введен параметр Р_i= ΔрН_мi - ΔрН_к . где i=30, 60 и 90. Аналогично были обработаны данные для всех исследованных времен экспозиции и усреднены по трем повторениям. Анализ усредненных данных для параметра Р_i для всех исследованных времен экспозиции показал уменьшение параметра ΔрН_мi маркированных дрожжей относительно контрольной суспензии. На рисунке 3.3 приведены результаты расчетов усредненного по трем повторениям параметра Р_i для трех времен экспозиции.

Рисунок 3.3 – Зависимость параметра Р_i от времени маркировки

Из анализа данных, приведенных на рисунке 3.3 видно, что параметр Р_i зависит от времени маркировки. При этом необходимо отметить, что для 30 минуты маркировки убыль протонной экструзии наименьшая, а для 60 и 90 минут убыль протонной экструзии существенно увеличилась. Этот факт может свидетельствовать об ухудшении физиологического состояния дрожжевых клеток, которое может быть обусловлено блокированием поглощения экзогенной глюкозы и вывода протонов из клетки. Такая блокировка может вызываться магнитными наночастицами, адсорбированными на клеточной стенке.

Таким образом, с помощью теста «силы подкисления» показано, что после магнитной маркировки дрожжевых клеток наночастицами, стабилизированными ПВС, клетки в целом сохраняют свою жизнеспособность, но наблюдается снижение выхода протонов из клетки, что можно интерпретировать как ухудшение физиологического состояния маркированных клеток.

Так как одним из применений магнитомаркированных дрожжевых клеток является их использование в качестве магнитоуправляемых биосорбентов, то необходимо было проверить, возможно ли управлять движением магнитомаркированных клеток с помощью градиентного магнитного поля.

Так как результаты исследований жизнеспособности магнитомаркированных клеток показали, что при времени магнитной маркировки 60 и 90 минут наблюдается значительное ухудшение их жизнеспособности (см. данные на рисунках 3.1 и 3.3), то исследование магнитных свойств маркированных клеток проводилось только для суспензии, маркированной при времени экспозиции 30 минут. Так как основным свойством магнитомаркированных дрожжевых клеток (при использовании их в качестве магнитоуправляемых биосорбентов) является возможность захвата этих клеток на магнитные концентраторы, то оценку изменения магнитных свойств дрожжевых клеток после магнитной маркировки производили по наличию магнитофореза маркированных клеток в градиентном магнитном поле. Магнитофорез клеток, маркированных наночастицами, стабилизированными ПВС, наблюдали в следующем эксперименте. Каплю суспензии магнитомаркированных дрожжей помещали на покровное стекло, расположенное над цилиндрическим магнитом, который создавал над плоскостью покровного стекла градиентное магнитное поле, и оставляли для высыхания. Магнит представлял собой цилиндр с диаметром Д=3 мм и высотой h=6 мм, намагниченный вдоль продольной оси. Индукция над поверхностью полюса магнита в плоскости, где располагалась капля дрожжевой суспензии составляла В=0,4 Т.

Процесс высыхания капли дрожжевой суспензии наблюдали под микроскопом и фиксировали цифровым фотоаппаратом. Через некоторое время (после высыхания капли) изучали распределение магнитомаркированных клеток в высохшей капле под микроскопом. Результаты наблюдений представлены на рисунке 3.4.

Рисунок 3.4 – Процесс концентрирования магнитомаркированных клеток в градиентном поле магнита.

Наблюдение за процессом высыхания капли суспензии магнитомаркированных дрожжей показало, что через время меньшее минуты проявлялся процесс повышения концентрации маркированных дрожжевых клеток над полюсом магнита (рисунок 3.4). Так как известно, что индукция магнитного поля максимальна вблизи магнита, и ослабевает при удалении от него, следовательно, мы наблюдаем результат движения магнитомаркированных клеток в область повышенной индукции магнитного поля. После полного высыхания капли покровное стекло снимали с магнита и фотографировали полученное распределение магнитомаркированных клеток в высохшей капле (рисунок 3.4). На рисунке 3.4 видно, что, после снятия с магнита покровного стекла с высохшей каплей, в том месте, где он располагался, сформировалась область повышенной концентрации клеток. Этот факт свидетельствует о том, что под действием градиентного магнитного поля происходит движение клеток, маркированных наночастицами с покрытием ПВС при времени экспозиции 30 минут. Следовательно, движением маркированных клеток можно управлять магнитным полем, а значит, при необходимости, их можно сепарировать магнитным сепаратором. Аналогичные эксперименты, выполненные для контрольной суспензии дрожжевых клеток, не подвергавшихся процедуре магнитной маркировки, показали отсутствие движения и изменения концентрации клеток в капле высыхающей суспензии, расположенной над магнитом.

ВЫВОДЫ

Таким образом, в настоящей работе получены следующие результаты.

• Показано, что с помощью магнитных наночастиц, стабилизированных поливиниловым спиртом, можно магнитомаркировать дрожжевые клетки с сохранением их жизнеспособности.

• установлено, что магнитомаркирование дрожжевых клеток наночастицами с ПВС приводит к увеличению доли мертвых клеток в популяции, причем это увеличение пропорционально времени магнитной маркировки, следовательно, при исследованных условиях маркировки магнитные наночастицы, стабилизированные ПВС проявляют цитотоксичность по отношению к дрожжевым клеткам.

• С помощью теста «силы подкисления» показано, что после магнитной маркировки дрожжевых клеток наночастицами, стабилизированными ПВС, наблюдается снижение выхода протонов из клетки, что можно интерпретировать как ухудшение физиологического состояния маркированных клеток.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Wilhelm C., Gazeau F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles // Biomaterials. 2008. Vol. 29. P. 3161–3174.

2. Liu X. Q., Xing J. M., Guan Y. P., Shan G. B., Liu H. Z. Synthesis of amino-silane modified superparamagnetic silica supports and their use for protein immobilization // Colloids and Surfaces A : Physicochem. Eng. Aspects. 2004. Vol. 238. P. 127–131.

3. Hiergeist R., Andra W., Buske N., Hergt R., Hilger I., Richter U., Kaiser W. Application of magnetite ferrofluids for hyperthermia // J. Magn. Magn. Mater. 1999. Vol. 201. P. 420–422.

4. Astalan A. P., Ahrentorp F., Johansson C., Larsson K., Krozer A. Biomolecular reactions studied using changes in brownian rotation dynamics of magnetic particles // Biosensors Bioelectron. 2004. Vol. 19. P. 945–951.

5. Safarik I., Safarikova M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1999. Vol. 722. P. 33–53.

6. Bucak S., Jones D. A., Laibinis P. E., Hatton T. A. Protein Separations Using Colloidal Magnetic Nanoparticles // Biotechnol. Prog. 2003. Vol. 19. P. 477−484.

7. Ma Z., Guan Y., Liu H. Superparamagnetic silica nanoparticles with immobilized metal affinity ligands for protein adsorption // J. Magn. Magn. Mater. 2006. Vol. 301. P. 469–477.

8. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Van Dillen P. M. E., Van Der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. Vol. 28. P. 495–503.

9. Ugelstad J., Prestivik W.S., Stenstad P., Kilaas L., Kvalheim G. Selective cell separation with monosized magnetizable polymer beads // Magnetism in Medicine: А Hаndbook / ed. А. Nowak. 1998. Wiley: N.Y.; Berlin. P. 471.

10. Pinto A. D., Forte V. T., Guastadisegni M. C., Martino C., Schena F. P., Tantillo G. A comparison of DNA extraction methods for food analyses // Food. Control. 2007. Vol. 18. P. 76–80.

11. Horák D., Ritttich B., Safá J., Spanová A., Lenfeld J., Benes M. J. Properties of RNase an immobilized on magnetic poly(2-hydroxyethyl methacrylate) microspheres // Biotechnol. Progr. 2001. Vol. 17. P. 447–452.

12. Ugelstad J., Prestivik W.S., Stenstad P., Kilaas L., Kvalheim G. Selective cell separation with monosized magnetizable polymer beads // Magnetism in Medicine : A Handbook / ed. A. Nowak. 1998. Wiley ; N.Y. ; Berlin. P. 471.

13. Liu T. Y., Hu S. H., Liu K. H., Liu D. M., Chen S. Y. Study on controlled drug permeation of magnetic-sensitive ferrogels: effect of Fe3O4 and PVA // J. Control. Release. 2008. Vol. 126. P. 228–236.

14. Chan D. C. F., Kirpotin D. B., Bunn P. A. Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron oxides for the site specific radiofrequency-induced hyperthermia of cancer // J. Magn. Magn. Mater. 1993. Vol. 122. P. 374–378.

15. Vainstein M, Suzina N, Sorokin V (1997) A new type of magnet-sensitive inclusions in cells of photosynthetic purple bacteria. SystemApplMicrobiol: GustavFischerVerlag 182–186.

16. Schumann D, Raub T. D, Kopp R. E, Guerquin-Kern J. L, Wu T. D, et al. (2008) Gigantism in unique biogenic magnetite at the Paleocene-Eocene Thermal Maximum. ProcNatlAcadSci U S A 105: 17648–17653.

17. Cheng K., Li T.S., Malliaras K. at al. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. – Circ. Res., 2010. – P.106.

18. Landázuri N., Tong S., Suo J. at al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. –Sl., 2013.– P. 9.

19. Vanecek V., Zablotskii V., Forostyak S. at al. Highly efficient magnetic targeting of mesenchymal stem cells in spinal cord injury // Nanomedicine. – Sl, 2012. –P.37.

20. Schäfer R., Bantleon R., Kehlbach R. at al. Functional investigations on human mesenchymal stem cells exposed to magnetic fields and labeled with clinically approved iron nanoparticles. BMC Cell Biol. 2010; 11: 22.

21. Yanai A., Häfeli U.O., Metcalfe A.L. at al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell Transplant. 2012; 21: 1137-48.

22. Chaudeurge A., Wilhelm C., Chen-Tournoux A. at al. Can magnetic targeting of magnetically labeled circulating cells optimize intramyocardial cell retention? Cell Transplant. 2012; 21: 679-91.

23. Sakamoto J.H., van de Ven A.L., Godin B. et. al. Enabling individualized therapy through nanotechnology // Pharmacol. Res. 2010. Vol. 62, N 2. P. 57–89.

24. Glasauer S, Langley S, Beveridge T. J (2002) Intracellular iron minerals in a dissimilatory iron-reducing bacterium. Science 295: 117–119.

25. Губин, С. П. Магнитные наночастицы: методы получения, строение, свойства / Ю. А. Кокшаров, Г. Б. Хомутов, Г. Ю. Юрков. // Успехи Химии. - 2005. - Т. 74. - № 6. - С. 539-574.)

26. Гусев, А. И. Нанокристаллические материалы / А. И. Гусев, А. А. Рампель. - Москва: Физматлит, 2001. - 126 с.)

27. Salata O.V. Applications of nanoparticles in biology and medicine [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.jnanobiotechnology.com/content/2/1/3)

28. Azevedo R.B., Silva L.P., Lemos A.P.С., Bao S.N., Lacava Z.G.M., Safarik I., Safarikova M., Morais P.C. Morphological study of Saccharomyces cerevisiae cells treated with magnetic fluid // IEEE Transactions on Magnetics. – 2003. – V. 39, I. 5. – P. 2660–2662.)

29. Павлович С.А. Магнитная восприимчивость организмов. – Мн.: Наука и техника, 1985. – 110 с.

30. Yu J.X. A simple method to prepare magnetic modified beer yeast and its application for cationic dye adsorption / J.X. Yu, L.Y. Wang, R.A. Chi et al. // Environmental Science and Pollution Research. – 2013. – №20. – P. 543–551.

31. Safarik I. Hydrogen peroxide removal with magnetically responsive Saccharomyces cerevisiae cells / I. Safarik, Z. Sabatkova, M. Safarikova // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2008. – №56. – P. 7925-7928.

32. Першина А.Г., Сазонов А.Э., Мильто И.В. Использование магнитных наночастиц в биомедицине // Бюллетень сибирской медицины. – 2008. - № 2. – C.70-78

33. Туранская С.П., Кусяк А.П., Туров В.В., Горбик П.П. Взаимодействие магнитных наночастиц с клетками // Поверхность. - 2013. Вып. 5(20). - С. 227–246

34. Wilhelm C., Lavialle F., Péchoux C., Tatischeff I. and Gazeau F., “Intracellular Trafficking of Magnetic Nanoparticles to Design Multifunctional Biovesicles,” Small, Vol. 4, No. 5, 2008, pp. 577-582. doi:10.1002/smll.200700523

35. Azevedo R.B., Silva L.P., Lemos A.P.С., Bao S.N., Lacava Z.G.M., Safarik I., Safarikova M., Morais P.C. Morphological study of Saccharomyces cerevisiae cells treated with magnetic fluid // IEEE Transactions on Magnetics. – 2003. – V. 39, I. 5. – P. 2660–2662.

36. Вольтер Е.Р. Биофизико-химические аспекты получения и применения коллоидов магнетита: Автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.02. – Сухум, 2005. – 119 с.

37. Leeper N.J., Hunter A.L., Cooke J.P. Stem cell therapy for vascular regeneration: Adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells // Circulation. – 2010. – V. 122. – P. 517–526.

38. Loebinger M.R., Kyrtatos P.G., Turmaine M., Price A.N., Pankhurst Q., Lythgoe M.F., Janes S.M. Magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells homing to pulmonary metastases using biocompatible magnetic nanoparticles // Cancer Res. – 2009. – V. 69, N 23. – P. 8862–8867.

39. Könczöl M., Ebeling S., Goldenberg E., Treude F., Gminski R., Giere R., Grobéty B., Rothen-Rutishauser B., Merfort I., Mersch-Sundermann V. Cytotoxicity and genotoxicity of size-fractionated iron oxide (magnetite) in A549 human lung epithelial cells: Role of ROS, JNK and NF-κB // Chem. Res. Toxicol. – 2011. – V. 24, N 9. – P. 1460–1475.

40. Shuklа R., Bаnsal V., Chaudhary M., Basu А., Bhonde R.R., Sastry M., Langmuir 2005, 21, 10644

41. Lunov O., Syrovets T., Büchele B., Jiang X., Röcker C., Tron K., Nienhaus G.U., Walther P., Mailänder V., Landfester K., Simmet T. The effect of carboxydextrancoated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on c-Jun N-terminal kinasemediated apoptosis in human macrophages // Biomaterials. – 2010. – V. 31, I. 19. – P. 5063–5071

42. Кособудский И. Д., Симаков В. В., Ушаков Н. М., Юрков Г. Ю. Физическая химия наноразмерных объектов : композиционные материалы. Саратов : Сарат. техн. ун-т, 2008. 230 с.

43. Бабьева И.П. Семейство сахаромицетовые (Saccharomycetaceae) и другие группы дрожжей // Жизнь растений / Под ред. проф. М. В. Горленко. – М.: Просвещение, 1976. – Т. 2. Грибы. – С. 91-106.

44. Fakhrullin F., Lubov V., Shlykova, Alsu I. Zamaleeva, Danis K. Nurgaliev, Yuri N. Osin, Javier Garcı´a-Alonso, Vesselin N. Paunov\\Macromol. Biosci, 2010. –, P. 1257–1264.

45. Zhu X.M., Wang Y.X., Leung K.C. at al. Enhanced cellular uptake of aminosilane-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles in mammalian cell lines. Int. J. Nanomedicine. 2012; 7: 953-64.

46. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 2005; 26: 3995-4021.

47. Cromer Berman S.M., Walczak P., Bulte J.W. Tracking stem cells using magnetic nanoparticles. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2011; 3: 343-55.

48. Riehemann K., Schneider S.W., Luger T.A., Godin B., Ferrari M., Fuchs H. Nanomedicine – challenge and perspectives // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009. Vol. 48, N 5. P. 872–897.

49. Sakamoto J.H., van de Ven A.L., Godin B. et. al. Enabling individualized therapy through nanotechnology // Pharmacol. Res. 2010. Vol. 62, N 2. P. 57–89.

50. Glasauer S, Langley S, Beveridge T. J (2002) Intracellular iron minerals in a dissimilatory iron-reducing bacterium. Science 295: 117–119.

51. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976 Добиш. Электрохимические константы. М., 1980 Чиркин А. и др. Диагностический справочник терапевта. Минск. 1993)

52. MaaXen S., Fattal E., Muller R.H., et al. Cell cultures for the assessment of toxicity and uptake of polymeric particulate drug carrier // STP Pharma Sci. 1993. V.3(1). P.11-22.

53. Kissel T., Roser M. Influence of chemical surface-modifications on the phagocityc properties of albumin nanoparticles // Proceedings of the International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials. 1991. V.18. P.275.

54. Huang, H. Mössbauer spectroscopy of protein−passivated iron oxide nanoparticles / H. Huang, R. Christmann, R. Ulber, V. Schu nemann // Hyperfine Interactions. − 2012. − V. 205, Iss. 1−3. − P.121—124.

55. Бейтс Р. Определение рН. Теория и практика / пер. с англ. под ред. акад. Б. П. Никольского и проф. М. М. Шульца. — 2 изд. — Л. : Химия, 1972.

56. Добычин, Д.П. Физическая и коллоидная химия. – 1986. – 464 с.

57. Нуриев А. В. Металлополимерные нанокомпозиты на основе соли Fe (III) и полимеров – поливиниловый спирт (ПВС) и полиакрилонитрил (ПАН), полученные химическим восстановлением // Тезисы докладов 17-ой Всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика 2010», Зеленоград – МИЭТ – 28-30 апреля 2010 г. – С. 50.

58. Горобець С.В., Карпенко Ю.В., Маринченкo Л.В. Використання магнітокерованих дріжджів S. сеrevisiae для вилучення іонів міді // Вісник Донецького Національного Університету, Сер. А: Природничі науки. – Донецьк, 2010. – Вип. 1. – С. 230-236.

59. Горобець С.В., Чиж, Ю.М. Ковальов О.В., Шпетний І.О. ефективність магнітокерованого біосорбенту на основі дріжджів Sacharomyces cerevisiae для очищення стічних вод // Наукові вісті НТУУ «КПІ». – 2015. – Вип. 3. – С. 14 – 22

60. Гаранин Р.А. Метод биосорбции тяжелых металлов из промышленных сточных вод с использованием пивоваренных дрожжей Saccharomyces cerevisiae: Автореф. дис… канд. биол. наук. – М., 2011. – 21 с.

61. Туранская С.П., Кусяк А.П., Туров В.В., Горбик П.П. Взаимодействие магнитных наночастиц с клетками // Поверхность. – 2013. – Вып. 5. - № 20. – С. 227 – 246

62. M. Opekarova, K. Sigler Acidification Power: Indicator of Metabolic Activity and Autolytic Changes in Saccharomyces cerevisiae // Folia Microbiol. – 1982. V. – 27. P. 395 – 403

63. Karel Sigler Acidification Power (AP) Test and Similar Methods for Assessment and Prediction of Fermentation Activity of Industrial Microorganisms // Kvasny prum. 2013. V. – 59. P. 204 – 208

64. Sigler K., Höfer M. Mechanisms of acid extrusion in yeast // Biochimica et Biophysica Acta. – 1991. – V. 1071. – P. 375 – 391