Количественное определение и изучение почвенных микроорганизмов

Инструкционная карта №8.

на выполнение практического занятия по дисциплине
ОП.05. Микробиология, санитария и гигиена
для обучающихся специальности 35.02.05 Агрономия

Тема: Количественное определение и изучение почвенных микроорганизмов.

Цель: Изучение основных методов исследования микрофлоры почвы.

Норма времени: 2 ак.часа.

Оснащение рабочего места: инструкционные карты, конспекты лекций.

Информационное обеспечение обучения: справочная литература.

Компетенции, знания, умения и навыки, которыми должны овладеть обучающиеся: У-3, У-4; З-1, З-2-4, З-6-8, З-11, З-15.

ОК-1, ОК-2, ОК-4, ОК-5, ОК-8, ОК-9.

Вопросы для актуализации опорных знаний:

1. Микрофлора почвы включает в себя группы микроорганизмов?

2. Санитарное состояние почвы оценивают по признакам?

Общие сведения.

Населяющие почву многочисленные популяции и группы популяций разнообразных организмов, различающиеся по эколо­гическим функциям и таксономическому положению, объединя­ются общим понятием «почвенная биота».

Почва является средой обитания большого числа разнооб­разных микроорганизмов. В 1 г почвы содержится от 1 до 10 млрд клеток микроорганизмов. В почве активно протекают процессы разложения органических природных веществ, при участии широ­кого разнообразия сапрофитных микроорганизмов.

Для выявления, изучения и учета численности почвенных микроорганизмов используют прямые методы микроскопирования и методы посева из разведений почвенной суспензии на плотные и жидкие среды.

Для прямого микроскопического изучения почвы приме­няется метод Виноградского в различных модификациях. Суть его заключается в том, что почвенную суспензию, нанесенную на предметное стекло, фиксируют и окрашивают карболовым эритрозином. Окрашенные клетки просчитывают под микроскопом.

Несмотря на то, что методы прямого микроскопирования позволяют выявить и учесть значительно большее количество микроорганизмов (число бактерий, учитываемых прямыми мето­дами, в тысячу раз превышает то, которое учитывается методом посева), метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов. Он позволя­ет не только учитывать количество, но и групповой (а часто и видовой) состав микрофлоры. Используя этот метод посева, мож­но из изолированных колоний, выросших на чашках, выделять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследова­ния и идентификации.

Отбор и подготовка почвенного образца дли микробиоло­гического анализа.

При отборе образцов почвы учитывают чрезвычайную макро-, мезо- и микрогетерогенность как микробиологических показателей почвы, так и других ее свойств. С пробной площадки отбирают 3-10 образцов и анализируют их отдельно. Это позво­ляет получить статистически достоверные результаты о среднем количестве микроорганизмов, а также дает возможность судить о разнообразии и степени разброса полученных данных.

Образцы почв для микробиологических исследований от­бирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые па­кеты или стеклянную посуду с ватными пробками и др.

При отсутствии возможности анализировать образцы непо­средственно после их

-сбора в течение нескольких часов высушива­ют на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.

-при подготовке почв к микробиологическому анализу необ­ходимо провести следующие операции:

- разрушить почвенные агрегаты;

- десорбировать микроорганизмы с поверхности почвен­ных частиц;

- выделить из органоминерального геля и дезагрегировать микроколонии микроорганизмов.

Для разрушения почвенных агрегатов чаше всего исполь­зуют метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.

Используют также метод обработки почвенной суспензии на электрической мешалке или на ультразвуковой установке.

Перед посевом влажную или сухую почву высыпают на часовое стекло, протертое спиртом, и освобождают от посторон­них включений.

Количественное определение общей микрофлоры

Прямые микроскопические методы

Прямые микроскопические методы дают возможность определять общее количество отдельных групп микроорганизмов. Однако даже и при применении прямых микроскопических методов можно подсчитать только количество бактерий. Особые микроскопические методы необходимо применять для подсчета грибов и совершенно специфические — для подсчета почвенных водорослей и беспозвоночных животных. Таким образом, когда определяется общее количество микроорганизмов в почве (точнее было бы говорить об определении общего количества бактерий), то из полученных данных можно определить только- биомассу бактерий, а не общую биомассу почвенных микроорганизмов.

Следует учитывать, что общее количество микроорганизмов (и их биомасса) характеризует только потенциальный запас микроорганизмов в почве, но эти цифры еще не говорят о том, какая часть микроорганизмов находится в активном, а какая часть в покоящемся состоянии.

Для получения более полной информации нельзя ограничиваться определением количества микроорганизмов и их биомассы на 1 г почвы, но необходимо проводить пересчет количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы с учетом количества микроорганизмов по всему почвенному профилю, расчета содержания микроорганизмов в столбике почвы с площадью поверхности в 1 см² (определения количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы).

Общее содержание микроорганизмов — величина консервативная и малоподвижная, поэтому определение его мало пригодно для установления влияния различных факторов на микрофлору почв (например, влияния пестицидов, удобрений и т. д.).

Прямые методы определяют в 1000 раз больше бактерий, чем посев на питательные, даже малоэлективные среды.

Часто для прямого микроскопического изучения почвы применяют метод С. Н. Виноградского, причем обычно пользуются модификацией этого метода, предложенной О. Г. Шульгиной. Тщательно отобранную среднюю пробу почвы массой в 5 г помещают в 250-миллилитровую колбу, содержащую 45 мл воды. Вода не должна содержать клеток микроорганизмов. По оригинальной прописи колбу энергично встряхивают 5 мин. Рекомендуется для более полного учета числа бактерий обрабатывать почвенную суспензию ультразвуком или при отсутствии ультразвуковой устновки на микроизмельчителе тканей. В течение нескольких секунд дают осесть наиболее крупным почвенным частицам и затем пипеткой, с точно вымеренной величиной капли, наносят одну каплю на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. Одновременно с каплей суспензии на стекло наносят каплю 0,1%-ного очищенного от микробных клеток агара. На стекле, на которое наносят суспензию, предварительно отмечают прямоугольник площадью в 8 см², ширина которого равна ширине стекла. Нанесенную взвесь при помощи покровного стекла помешивают и равномерно распределяют по поверхности всего прямоугольника. Препарат подсушивают и фиксируют над пламенем горелки или 96 % спиртом, окрашивают карболовым эритрозином (окрашивание длительное от 1 ч до суток). Краску смывают, последовательно погружая стекла в 4—5 стаканов с водой. Препараты высушивают и помещают под микроскоп (масляная иммерсия, 90Х).

Расчет количества клеток в 1 г воздушно-сухой или абсолютно сухой почвы проводят по формуле

А • 8 • 10⁹ • (Р+ 100)

Б • В • Г

где А — общее количество учтенных на стекле клеток; Б — площадь поля зрения (мкм²), определяется при помощи объект- микрометра; В — объем нанесенной суспензии (мл); Г — количество просчитанных полей зрения; Р — влажность почвы (%).

После проведения количественного учета микроорганизмов следует вычислить величину биомассы микроорганизмов в почве. Для этого нужно знать среднюю величину клетки микроорганизмов, которую можно получать после измерения под микроскопом размеров клеток, встречающихся в данной почве. Затем количество клеток в 1 г почвы умножается на средний объем клетки и на их удельный вес (1,10 г/см³). Часто делают пересчет биомассы микроорганизмов в т/га. Вычисляют вес живых клеток и вес сухих клеток.

Одним из наиболее совершенных методов выявления, изучения и количественного учета микроорганизмов в их естественной среде обитания является люминесцентная микроскопия в падающем свете. Метод сводится к тому, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашиваются специальным красителем (флуорохромом) акридином оранжевым (1:10000, 2-4 мин). При использовании данного метода достигается более уверенный подсчет бактерий в почве по сравнению с методом Виноградского. Яркие зеленые клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных частиц и препарата, причем микроскопия в отраженном свете позволяет учитывать и адсорбированные клетки, которые, как правило, не видны в проходящем свете (метод Виноградского).

Предложено несколько вариантов методов люминесцентной микроскопии для количественного учета почвенных микроорганизмов: от окрашивания почвенной суспензии с подсчетом микроорганизмов в специальных камерах или в капиллярах Перфильева до окрашивания фиксированных препаратов. Окрашивание готовых препаратов является наилучшей модификацией метода (метод Звягинцева и Кожевина). В этом случае отпадает необходимость в предварительном подборе оптимальной концентрации флуорохрома для каждой почвы, и не требуется специальной камеры для количественного подсчета. К тому же препараты до окрашивания и подсчета могут достаточно долго храниться, что позволяет проводить подсчет не по ходу опыта, а в удобное для исследователя время. Препарат из почвенной суспензии готовят аналогично предыдущему методу, но на площади 4 см², наносят 0,01 мл.

Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляют по формуле

М = 4•а•н • 10¹⁰,р

где М — количество клеток в 1 г почвы, а — среднее число клеток в поле зрения, р — площадь поля зрения (мкм²), н — показатель разведения.

Для подсчета рекомендуется из каждого почвенного образца готовить два препарата и на каждом препарате подсчитывать клетки в пяти полях зрения.

Современные электронные микроскопы с разрешением'2—5 А позволяют отличить мельчайшие микроорганизмы в почвенной суспензии и определить их численность.

Работы Д. И. Никитина показали, что в почвах содержится множество новых форм микроорганизмов, которые не определяются с помощью других методов. При применении методов предварительного диспергирования почвы и десорбций микроорганизмов с помощью электронной микроскопии удается подсчитать наибольшее ко сравнению с другими методами количество микробов.

Диспергированную почвенную суспензию помещают в стерильный мешочек из синтетического полупроницаемого материала и подвергают диализу в стерильной дистиллированной воде в течение 3—12 ч. После диализа взвесь в количестве 3-8 мкл наносят стерильной микропипеткой на пленки-подложки для электронного микроскопа. После высыхания капель препараты оттеняют металлом (хромом или окисью вольфрама) и просматривают в электронном микроскопе. Для получения достоверных данных необходима вариационно-статистическая обработка материала, позволяющая установить ошибку средней арифметической, разброс рассчитанных величин, точность и надежность опыта.

Ход работы:

Задание №1. Законспектировать методику определения микрофлоры почвы.

Техника посева

1. Навеску подготовленной почвы в 1 г переносят в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды.

2. Готовят разведения почвенной суспензии, для чего 1 мл суспензии из колбы последовательно переносят в ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды.

3. Посев на плотные среды производится из разных разведе­ний. Разведение для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50-200 колоний.

4. Из каждого образца берут не менее трех повторных наве­сок и каждую высевают не менее чем на трех чашках.

5. На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю почвенной суспензии определенного разведения и с по­мощью стеклянного шпателя распределяют ее по всему агару.

Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помеща­ют в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно, на 2-3 сут инкубации учитывают споровые и неспо­ровые формы бактерий. На среде Чапека на 5-7-е сут учитывают колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5-7-е сут - колонии грибов и дрожжей.

Подсчет количества колоний на чашке проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной коло­нии чернилами по стеклу или маркером ставится точка.

Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г почвы по формуле: 

а = б * в *г, где

а - количество клеток в 1 г почвы;

б - среднее количество колоний на чашке;

в - разведение, из которого сделан посев; г- количество капель в 1 мл суспензии.

Результаты обрабатывают статистически, рассчитывают ошибку среднего арифметического, среднее квадратичное откло­нение и коэффициент вариации.

Задание№2. Законспектировать количественное определение общей микрофлоры и прямые микроскопические методы.

Задание№3. Ответить письменно на контрольные вопросы и сформулировать вывод.

Контрольные вопросы:

1. Какие группы микроорганизмов исследуют в пробах почвы?

2. Какое время необходимо для проведения микробиологического анализа почвы?

3. В каком объеме почвы принято учитывать концентрацию микроорганизмов?