Курсовая работа - МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ОРХИДЕИ ФАЛЕНОПСИС (Phalaenopsis)

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГОПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГУМАНИТАРНО-ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

КАФЕДРА БОТАНИКИ

Курсовая работа

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ОРХИДЕИ

ФАЛЕНОПСИС (Phalaenopsis)

Работу выполнила:
студентка 621 группы
Естественнонаучного факультета
Дементьева Нина Сергеевна
______________________________
(подпись)
«Допущена к защите»	Руководитель:
Руководитель:____________________	ассистент кафедры ботаники
(подпись)
«____»_____________20__г.	Лаврский Алексей Юрьевич
Дата защиты: «___»____________20__г.
Оценка:__________________________
Руководитель: ____________________
(подпись)

ПЕРМЬ

2015

Оглавление:

Введение…………………………………………………………………………3

Обзор литературы……………………………………………………………….7

1. Биологические особенности__________________________________7

1.1 Строение и биологическое описание_______________________9

1.2 Характеристика основных мест произрастания______________11

1.3 Систематика орхидей___________________________________14

1.4 Фаленопсис – Phalaenopsis_______________________________14

1.5 История открытия______________________________________14

1.6 Проблема охраны исчезающих видов______________________15

2. Размножение растений_______________________________________15

2.1 Микроклональное размножение__________________________17

2.1.1 Типы клонального микроразмножения_______________17

2.1.2 Преимущества клонального клонального микроразмно-жения_______________________________________________18

2.1.3 Этапы клонального микроразмножения______________19

2.1.4 Проблемы и перспективы клонального микроразмно-жения_______________________________________________21

2.1.5 Введение в культуру использованием различных типов эксплантов___________________________________________21

2.1.6 Методики_______________________________________23

2.1.6.1 Среда Мурасиге-Скуга Туровской________________________________________23

2.1.6.2 Среды Т.М. Черевченко и Г.П. Кушнир__________________________________________23

2.1.7 Влияние факторов питательной среды на оптимизацию процесса прорастания семян____________________________25

2.1.8 Начальные этапы роста и развития в культуре in-vitro__28

2.1.9 Особенности адаптации регенерантов условиям

ex-vitro______________________________________________30

Методика…………………………………………………………………………33

1. Введение растений в культуру________________________________33

2. Состав стандартной среды МС________________________________34

3. Приготовление и использование цитокининовой пасты___________35

Заключение………………………………………………………………………37

Список литературы………………………………………………..……………38

Введение

Проблемы, связанные с охраной окружающей среды, были и остаются одними из самых острых проблем во всех странах мира. Однако только в конце XX века, исходя из понимания того факта, что Человек является таким же живым существом, как и другие биологические виды, была осознана зависимость благополучия человеческого общества от устойчивости и сохранности биологического и ландшафтного разнообразия на планете Земля. Принятие в 1993 году в Рио-да-Жанейро Конвенции о биологическом разнообразии является ярким подтверждением вышесказанного. Российская Федерация присоединилась к данной Конвенции в 1995 году.

Важнейшей формой сохранения биологического и ландшафтного разнообразия является организация особо охраняемых природных территорий (далее ООПТ). Формы ООПТ в разных странах весьма разнообразны, но их задачи близки. Важнейшая из них – сохранение биологического и ландшафтного разнообразия, поддержание в естественном состоянии природных комплексов и объектов.

Формирование сети ООПТ Пермского края по сути началось в 1911 году с опубликования П.В.Сюзевым в Записках Уральского общества любителей естествознания статьи «Охрана памятников природы». Уже в 1923 г. Он сформулировал ботанико-географические основы выделения памятников природы. На последующем этапе несомненны заслуги в формировании сети ООПТ: Э.Э.Аникиной, Л.В.Баньковского, Т.П.Белковской, К.А.Горбуновой, В.И.Маковского, Г.А.Максимовича, С.А.Мамаева, А.К.Шарца и других.

Современная система ООПТ края начала формироваться с 80-х годов 20-го столетия. Научная составляющая была подготовлена учеными Пермского государственного и Пермского государственного гуманитарно-педагогического университетов. Правовая основа существующих ООПТ подготовлена краевыми органами охраны природы, которыми долгие годы руководил В.В.Казанцев.

В настоящее время ООПТ на территории Пермского края представлены федеральными, региональными и местными объектами. Федеральные ООПТ – государственные природные заповедники «Басеги» и «Вишерский». 282 ныне существующих ООПТ регионального значения представлены государственными природными заказниками (20 штук), памятниками природы (114), историко-природными комплексами и объектами (5), природными резерватами (46) и охраняемыми ландшафтами(97). На территории края имеется также 51 ООПТ местного значения.

Помимо ООПТ есть и создаются специализированные сады, в которых поддерживается климат, схожий с тем, где произрастают растения. Всего в России насчитывается 76 ботанических садов и других интродукционных центров, работа которых координируется Советом ботанических садов России. К числу крупнейших ботанических садов, внесших наибольший вклад в сохранение исчезающих растений ex-situ, относятся:

• Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН, г. Москва. Общая площадь 361 га. Коллекции растений - более 21 000 названий (в том числе, около 10 тыс. садовых форм и сортов). Коллекция редких и исчезающих растений насчитывает 320 видов.

• Ботанический сад Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН, г. Санкт-Петербург. Общая площадь 22,6 га. В коллекциях собрано 11 664 таксона, среди них более 300 видов редких и исчезающих растений России, и сопредельных стран.

• Ботанический сад научно-производственного объединения "Нива Ставрополья" РАСХН, г. Ставрополь. Общая площадь 207 га. В коллекционных фондах более 5000 таксонов. Редкие и исчезающие растения представлены 291 видом.

• Ботанический сад Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва. Общая площадь 36 га. В саду насчитывается 6,5 тыс. видов, сортов и культур растений, в том числе 74 редких и исчезающих вида России и 92 - Московской области.

• Ботанический сад Уральского отделения РАН, г. Екатеринбург. Общая площадь 50 га. В коллекциях собрано около 3000 таксонов, в том числе 130 редких видов Урала.

• Ботанический сад-институт Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток. Общая площадь 170 га. В коллекциях насчитывается свыше 4000 таксонов. Число редких и исчезающих видов - 120. Из них 100 - виды местной флоры.

• Полярно-альпийский ботанический сад-институт РАН, г. Кировск. Общая площадь 350 га. Число видов в коллекциях более 2000, из них 120 - редкие и исчезающие.

• Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Общая площадь 1062 га. В ботанических коллекциях насчитывается около 5000 таксонов, в том числе, редких и исчезающих видов - 92.

Основные направления работ по сохранению ex-situ растений в России:

1. Разведение в неволе редких видов с целью реинтродукции в природную среду для поддержания существующих, восстановления утраченных и создания новых популяций in-situ;

2. Разведение хозяйственно ценных видов для увеличения ресурсов эксплуатируемых популяций;

3. Содержание и разведение в культурно-просветительских целях.

4. Выращивание объектов в среде Мурасиге–Скуга, или в среде Кнудсона, в пробирке способом in-vitro.

Данная работа посвящена последнему направлению, а именно, микроклональному размножению.

Термином клональное микроразмножение называют массовое бесполое размножение растений в культуре в культуре тканей и клеток, при котором возникшие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру.

Этот метод позволяет за короткий срок получать большое количество однородного посадочного материала растений. Коэффициенты клонального микро размножения достигают 10⁵ –10⁷ растений в год, что в несколько тысяч раз больше, чем при использовании традиционных методов вегетативного размножения.

Клональное микроразмножение значительно ускоряет селекционный процесс, сокращая сроки получения товарной продукции новых сортов до 2–3 лет вместо 10–12. И важно отметить, что при размножении растений в культуре тканей происходит их освобождение от патогенных микроорганизмов и во многих случаях от вирусов. В процессе размножения нет риска повторно заразить растения. А также возможно оздоровление посадочного материала и это значительно улучшает качество продукции.

Также этот способ позволяет экономить пространство. Тысячи размноженных растений легко размещаются на небольших площадях климатических камер. В культуре тканей можно поддерживать рост растений круглый год, что важно для растений, имеющих в цикле своего развития периоды покоя. При выращивании растений с длительной ювенильной фазой можно добиться ускоренного перехода от ювенильной к репродуктивной фазе развития, и, наконец, методом культуры тканей удаётся размножать растения, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно.

В качестве объекта исследований автором выбраны представители семейства Орхидных (Orchidaceae).

Орхидные — это крупнейшее семейство однодольных растений. Известно около 30 000 видов дикорастущих орхидей, что составляет

почти 10 % всех растений в мире. Около 17 000 видов находятся под угрозой исчезновения.

Многие орхидеи опыляются только определенными видами животных — когда эти животные вымирают, погибают и орхидеи. Ежегодно ученые описывают новые виды орхидей.

При слове «орхидея» обычно представляется экзотический цветок, растущий в тропических джунглях. Однако орхидеи встречаются даже в России, но эти северные виды выглядят скромнее.

Из 136 видов орхидных, произрастающих на территории России, 44 занесены в Красную книгу России.

Характеристика таксонов растений Пермского края, состояние которых в природной среде требует особого внимания:

• Венерин башмачок пятнистый – Cypripedium guttatum Sw.;

• Хаммарбия болотная – Hammarbya paludosa(L.) O. Kuntze (Malaxispaludosa(L.) Sw.);

• Тайник сердцевидный – Listera cordata(L.) R. Br.;

• Тайник яйцевидный – Listera ovata (L.) R. Br.;

• Любка двулистная – Platanthera bifolia(L.) Rich.;

• Ладьян трехнадрезной – Corallorhiza trifida Chatel.;

• Дремлик широколистный – Epipactis helleborine(L.) Crantz;

• Дремлик темно-красный – Epipactis atrorubens(Hoffm. ex Bernh.) Bess.;

• Гудайера ползучая – Goodyera repens (L.) R. Br.;

• Пололепестник зеленый – Coeloglossum viride (L.) C. Hartm.;

• Кокушник длиннорогий – Gymnadenia conopsea(L.) R. Br. ;

• Пальчатокоренник мясо-красный – Dactylorhiza incarnatа (L.) Soo;

• Пальчатокоренник кровавый – Dactylorhiza cruenta(O. F. Muell.) Soo;

• Пальчатокоренник болотолюбивый – Dactylorhiza elodes(Griseb.) Aver.;

• Пальчатокоренник Руссова – Dactylorhiza russowii(Klinge) Holub;

Данные взяты из сайта Красной книги Пермского края.

Вегетирующие горшечные растения сем. Орхидных (Orchidaceae) рода Фаленопсис (Phaleanopsis) достаточно дороги, по сравнению с другими растениями, стоимость маленького отводка посаженного в субстрат будет составлять от 300 рублей, но чаще в магазинах встречается цена: 1000 или 1500 рублей.

Как видно высокая цена на это растение говорит нам о том, что оно трудно выращиваемо и имеет большой спрос на рынке товаров.

Данная работа посвящена изучению клонального микроразмножения орхидных на примере Орхидеи Фаленопсис (Phalaenjpsis)

Цель: освоить методику клонального микроразмножения Орхидеи Фаленопсис (Phalaenjpsis), адаптировать методику к применению в программе факультативных занятий для учащихся школ.

Задачи:

1. изучить биологические особенности орхидеи рода Phalaenopsis;

2. изучить материалы по микроклональному размножению орхидных;

3. Освоить изготовление агаризованных сред соответствующего состава и осуществить введение растений в культуру in-vitro.

4. получить регенеранты исследуемого растения;

Обзор литературы:

1. Биологические особенности

Многолетние микотрофные, иногда бесхлорофилльные, травы с клубненостными корнями или корневищами.

Орхидеи очень разнообразны по внешнему виду, размерам и образу жизни. Среди них есть наземные растения, лианы, эпифиты. Существует более 100 тысяч видов и сортов орхидей, однако далеко не все можно выращивать в комнатных условиях. Большинство из пригодных для выращивания в домашних условиях орхидей в природе являются эпифитными растениями. Это растения, живущие на других растениях, в основном на ветвях и стволах (иногда и на листьях).

Листья очередные (но у сапрофитов отсутствуют), простые и цельные, с параллельным жилкованием, обычно с влагалищным основанием.

Цветки обоеполые, зигоморфные, в соцветии кисть или колос, реже одиночные.

Околоцветник большей частью окрашенный, из 6 листочков в двух кругах. 3 листочка наружного круга почти одинаковые. 2 листочка внутреннего круга обычно короче и уже наружных листочков и направлены вверх. Третий листочек внутреннего крута околоцветника, называемый губой, при основании часто вытянут в короткий или длинный отросток -шпорец.

Тычинка одна (редко 2), сросшаяся нитью со столбиком в колонку (гиностемий), остальные тычинки превращены в стаминодии. Пыльник 2-гнездный; пыльцевые зерна либо склеены в массу, называемую поллинием, либо обособлены. В ряде случаев каждый поллнний снабжен ножкой, с помощью которой он прикрепляется к клейкой железке (прилипальцу), расположенной на конце клювика, являющегося видоизмененным стерильным рыльцем в виде пластинки, иногда 3-лопастной. Поллнний вместе с ножкой и железкой называется поллинарием. Само по себе пыльцевое зерно орхидей столь мелкое, что ее не разглядишь без лупы – 0,35—3,30 мм в длину и 0,08—0,30 мм в ширину. Липкие поллинии нужны для того, чтобы цепляться за лапки насекомых или прилепляется на спину опыляющих насекомых, а у некоторых орхидей он выстреливает на расстояние до нескольких метров. Насекомое, заползая в цветок за нектаром, переносит полиний в следующий цветок, в котором он прилипает к особому выросту называемому колонкой и переноситься на другие цветки. Так происходит перекрестное опыление.

Рылец 3, более или менее срастающихся и образующих вогнутый или чуть выступающий диск, или срастаются только 2 рыльца, а третье преобразуется в клювик. Завязь нижняя, часто скрученная, одногнездная, с 3 постенными плацентами и многочисленными семяпочками.

Плод - коробочка. Семена очень многочисленные (у некоторых видов до 3-4 млн. штук в коробочке), необычайно мелкие, обычно с широкой прозрачной сетчатой кожурой. Зародыш не дифференцирован на органы, а эндосперм отсутствует. Зародыш орхидей еще мельче пыльцы — 0,05—0,26 мм в длину и 0,04—0,19 мм в ширину. Эндосперм (ткань, обеспечивающая питание зародыша) орхидных редуцирован, поэтому зародыши не способны развиваться без симбиоза с определенными видами микоризообразующих грибов.

Сеянцы развиваются медленно – до цветения проходит около пяти лет. Процесс созревания семян у некоторых видов может продолжатся до 2лет. В одном плоде может содержаться несколько миллионов семян. Семена у орхидей микроскопические и в них отсутствует запас питательных веществ (эндосперм), который служит питанием для развивающегося молодого растения. Поэтому для прорастания семян необходимы условия, в которых присутствуют грибы, в симбиозе с которыми семя орхидеи начинает развиваться. С момента посева семени до цветущего растения может пройти от 6 до 12 лет, в зависимости от вида. При разведении в колбах (in-vitro) этот период можно сократить в 2-3 раза.

Не удивительно, что при таком способе размножения орхидеи погибают вместе с вырубкой лесов и перепашкой земель.

Искусственно орхидеи размножают делением корневищ и псевдобульб.

Псевдобульбы – утолщенные стебли, служащие для запасов воды и питательных веществ. Некоторые виды орхидей и во взрослом состоянии питаются только с помощью грибов и называются сапрофитами. Отдельные виды обитают под землей вместе с грибами.

У орхидей есть два способа их размножения семенами и «детками». Размножение семенами и «детками» требует времени. Есть вариант того, что растение может погибнуть, так как это очень трудноразводимое растение и оно имеет множество заболеваний и вредителей.

Факторы негативно сказывающиеся на росте орхидей:

• Вирусная инфекция,

• солнечный или тепловой ожог,

• избыточное освещение,

• фузариозное увядание,

• бактериоз или мокрая бактериальная гниль,

• длительное нахождение воды,

• бактериальная пятнистость,

• септориоз,

• грибковая инфекция,

• филлостиклоз,

• альтернариоз,

• стангоспороз,

• недостаточное освящение,

• «сухая» гниль,

• естественный процесс старения,

• химический ожог,

• фомопсис;

• Вредители:

• Бабочки (мотыльки),

• Белокрылка,

• Долгоносик,

• Клопы,

• Мучнистый червец,

• Мыши,

• Нематоды,

• Панцирный клещ,

• Прозрачный клещ,

• Тля,

• Трипсы,

• Щитовка и ложнощитовка

• и т.д..

1.1 Строение и биологическое описание.

Стебель. Внешний вид орхидей чрезвычайно разнообразен, в специальной литературе рассматриваются различные типы побеговых систем этих растений. Молодой побег орхидеи называется ростом. Существует два основных типа ростов орхидей, названия которых до некоторой степени описательны.

Первый тип формирует новый сезонный рост каждый год от основания предыдущего роста, и этот новый рост образует собственные корни, цветы и затем дает начало новому росту следующего сезона. Он называется симподиальным. Такое растение состоит из нескольких стеблей, поднимающихся от ползучего наземного стебля, или ризомы, которую еще называют корневищем. Корневище расположено горизонтально и не имеет настоящих больших листьев. Оно является стеблевым, а не корневым образованием, и несет несколько чешуевидных листьев. У симподиальных орхидей верхушечная почка отмирает или дает начало генеративному побегу (цветоносу), а у основания вегетативного побега начинает развиваться новый побег.

Второй тип дает один главный возвышающийся стебель, растущий вверх каждый год и образующий новые листья на верхушке, но не обеспечивающий нового роста от основания. Он не имеет ризомы, не формирует псевдобульб и называется моноподиальным. У растений этой группы верхушечная почка сохраняется на протяжении всей жизни побега, и он, таким образом, обладает неограниченным ростом в длину. Цветоносы и воздушные корни выходят из промежутков между листьями, следуя друг за другом, год за годом. Со временем рост стебля замедляется и совсем прекращается при старении и отмирании растения. Примером таких растений являются ванды, аэридесы, фаленопсисы и другие.

Листья. Различие условий отражается и на форме, и на текстуре листьев, и на их окраске. Листья орхидей из местообитаний с выраженным сухим периодом, как правило, мясистые, они выполняют запасающую функцию. У таких растений иногда псевдобульбы редуцированы или вообще отсутствуют. Это, например, некоторые онцидиумы (Oncidium luridum, О. carthagenense, О. lanceanum и др.), трихоцентрумы, многие лелии. У орхидей, подверженных воздействию прямых солнечных лучей, в ряде случаев листья цилиндрической формы или близкой к ней (Vanda teres, V. hooke-riana).

Растения, требующие обилия света, на которые периодически попадают прямые солнечные лучи, обычно имеют плотные кожистые листья. Они часто обитают на верхних ветвях высоких деревьев и в других доступных солнцу местах. Это многие каттлеи, лелии, ванды с ремневидными листьями, аэридесы, аскоцентрумы и многие другие. На листьях растений, испытывающих действие прямого солнца, как и на псевдобульбах, часто имеется пурпурный налет.

Корни. Корни орхидей как эпифитных растений имеют ряд специфических особенностей.

Многочисленные тонкие корни образуются у растений, живущих на ветвях, покрытых слоем мха или обитающих в развилках ветвей с накапливающимся там гумусом. Такие корни иногда образуют «щетку», улавливающую опадающие листья и другие органические остатки. Они чаще встречаются у растений, сбрасывающих листья (катазетум) или обладающих крупными бульбами.

Немногочисленные толстые мясистые корни характерны для растений, поселяющихся на стволах деревьев (фаленопсисы, ванды, аэридесы). Они плотно присасываются к коре. В тропиках многие эпифиты образуют придаточные воздушные корни, поглощающие через многослойную по­верхностную ткань (т. н. веламен) воду из атмосферных осадков.

Веламен — особый слой омертвевших полых клеток. Им покрыты все корни эпифитных орхидей. Особое строение этого слоя позволяет впитывать влагу — дождевую воду или росу.

Благодаря своей гигроскопичности веламен также может поглощать влагу непосредственно из воздуха. Именно это его свойство позволяет корням эпифитных орхидей переживать длительные засушливые периоды.

Цветки орхидей обоеполые (исключение составляют катазетум и цикнохес). После того как растение отцветет, псевдобульба в безлистном состоянии может сохраняться на растении в течение нескольких лет. Цветки появляются на цветоносе, выходящем из верхушки псевдобульбы. Опыляются они насекомыми, а иногда и птицами.

Цветки орхидей очень разнообразны по форме и окраске, но построены по одной схеме: из трех наружных и трех внутренних лепестков, хотя часто из-за фантастической формы этих лепестков цветы выглядят весьма замысловатыми. Внешние лепестки — сепалии — закрывают остальной цветок в бутоне. Внутри находятся три петалии, одна из которых столь модифицирована, что внешне сильно отличается от двух остальных, и поэтому она имеет собственное название — губа, или лабеллум. Губа отличается от остальных лепестков не только формой, но и раскраской; часто она фантастически декорирована гребешками, рожками, разводами, протуберанцами и т. п. губа — обычно самая удивительная часть цветка, но у некоторых растений сепалии и петалии не менее декоративны.

Наиболее показательной для орхидей, ее визитной карточкой, является наименее заметная часть цветка. Это колонка — мясистая структура, расположенная в центре и состоящая из сросшихся органов воспроизведения. Колонка может быть совсем простой формы — белый, розовый или зеленый цилиндр. Она может выглядеть, как маленькая фигурка, кукла, птица, насекомое, лицо в очках или голова лебедя. Часто колонка декорирована крыльями, или чепчиком, или бахромой.

На верхушке колонки расположен пыльник, содержащий пыльцу, крупинки пыльцы скреплены воском в прочные шарики. Шарики, называемые поллиниями, лежат в полости, закрытой откидной шляпкой, где они выглядят, как пара глаз.

Чуть ниже пыльника, отделенный от него перегородкой, находится женский орган рыльце — глянцевая впадина, заполненная очень клейкой жидкостью. Колонка отгибается наружу от основания губы.

Характерными особенностями семян орхидных являются небольшие размеры (0,09–1,2мм) и отсутствие эндосперма, что затрудняет их прорастание и развитие проростков.

1.2 Характеристика основных мест произрастания.

Орхидеи распространены практически по всему земному шару. Однако для комнатной культуры наибольший интерес представляют виды, происходящие из тропических и субтропических областей Земли. Там орхидеи в основном обитают в тропических лесах.

Табл.1. Характеристика основных мест произрастания Орхидей

Тип леса	Сезонные изменения	Суточные изменения
Равнинный дождевой тропический лес.	Сезонные климатические колебания практически отсутствуют.	Незначительное пони­жение ночных темпера­тур по сравнению с дневными (на 4—6°С).
Горный дождевой тропический лес.	В сезонном цикле имеется короткий засушливый период.	Заметное снижение температуры ночью (на 10-15°С) при одновременном возрастании влажности.
Туманный тропический лес.	Сезонные климатические колебания слабо выражены.	Незначительное понижение ночных температур по сравнению с дневными (на 5—10°С).
Сезонный полулистопадный тропический лес.	В сезонном цикле имеется ярко выраженный сухой сезон, длящийся несколько месяцев.	Ночные температуры на 10-20°С ниже дневных. Во время сухого сезона ночью выпадают обильные росы, туманы и измороси.
Открытое местообитание.	Сезонные климатические колебания резко выражены.	Ночные температуры на 15-35°С ниже дневных. Ночью выпадают обильные росы.

Как видно из таблицы, условия в различных местах произрастания орхидей отличаются довольно сильно.

Наиболее ровные условия характерны для равнинных дождевых лесов. Сезонных и суточных колебаний параметров микроклимата там почти не наблюдается. В общем, условия почти «домашние». Не удивительно, что орхидеи, происходящие из этих районов, наиболее просты в культуре и самой природой как бы «приспособлены» для выращивания в комнатах.

Орхидеи, произрастающие в других районах, выращивать несколько труднее, так как для их успешного роста и развития необходимы довольно значительные суточные и сезонные изменения условий. Если этого не обеспечить, то растения будут плохо развиваться и, скорее всего, не зацветут. Именно поэтому при описании видов и родов орхидей, наиболее интересных для комнатной культуры, мы, как правило, указываем их типичное природное местообитание. Это очень важная информация, на которую стоит обратить пристальное внимание.

В жизни орхидей есть два основных периода, правильное чередование которых является залогом успешного выращивания практически всех их видов. Это периоды роста и покоя.

Во время периода роста развиваются новые боковые побеги у симподиальных орхидей и образуются листья у моноподиальных.

После окончания видимого роста, когда молодой прирост достигает своего максимального размера, наступает период относительного покоя. В этот период орхидеи не претерпевают никаких внешних изменений (за исключением листопадных видов, которые по мере вызревания прироста сбрасывают листья), но это не значит, что растения находятся в недеятельном состоянии.

Это очень важное время в жизни растения, в течение которого происходит не только «вызревание» тканей молодых побегов и листьев (они становятся более жесткими и плотными), но и другие сложные физиологические процессы, связанные с перераспределением питательных веществ и подготовкой к новому росту. Внутри почек возобновления симподиальных орхидей в это время происходит скрытая работа по заложению зачатков стеблей, почек, листьев, корней, а иногда даже и соцветий следующего побега.

Период покоя у разных видов орхидей имеет различную продолжительность. У видов, происходящих из стран с влажным тропическим климатом, период покоя обычно короткий и новый рост может начаться почти сразу после завершения развития последнего побега или листа. У растений, произрастающих в районах с заметными сезонными изменениями погоды, период покоя может быть очень продолжительным и длиться до полугода.

Чтобы уверенно выращивать орхидеи, надо знать, какие условия им необходимы в каждый период их жизни, и научиться правильно их соблюдать. Если вы это усвоили и прочувствовали, то все остальные премудрости агротехники орхидей вы постигнете без особых проблем.

1.3 Систематика орхидей.

Царство: Plantae – Растения

Отдел: Magnoliophyta – Цветковые

Класс: Liliopsida – Однодольные

Порядок: Asparagales – Спаржецветные (Орхидные)

Семейство: Orchidáceae – Орхидные

Группа: Spiranthinae – Спирантовые:

Группа: Cypripedioideae – Циприпедиевые:

Группа: Bletinae – Блетиевые:

Группа: Dendrobiinae – Дендробиумные:

Группа: Catasetinae – Катазетумные:

Группа: Maxillariinae – Максилляриевые:

Группа: Cymbididiinae – Цимбидиумные:

Группа: Epidendrinae – Эпидендриновые:

Род: Brassavola – Брассавола

Род: Cattleya – Каттлея

Род: Laelia – Лелия

Род: Epidendrum – Эпидендрум

Род: Leptotes – Лептотес

Род: Sophronitis – Софронитис

Род: Phalaenopsis – Фаленопсис

1.4 Фаленопсис – Phalaenopsis.

Фаленопсис— род эпифитных (иногда литофитных) травянистых растений семейства орхидные из Юго-Восточной Азии, Филиппин и северо-востока Австралии. В природных условиях обитают во влажных равнинных и горных лесах.

Многие представители рода и гибриды с их участием популярны в комнатном и оранжерейном цветоводстве, а также широко представлены в ботанических садах.

1.5 История открытия.

Первый представитель этого рода был найден на острове Амбон (Молуккские острова) немецким путешественником и натуралистом Георгом Румфом (1627—1702).

В 1752 г. шведский пастор Петер Осбек нашёл еще одно растение на маленьком островке по соседству с островом Тернате и послал гербарий Карлу Линнею, описавшему его в своей знаменитой работе «Виды растений» под именем эпидендрум прелестный (Epidendrum amabilis). Слово «эпидендрум» в переводе с древнегреческого означает «живущий на дереве».

В 1825 году директор Лейденского ботанического сада Карл Блюме нашёл ещё одно растение на маленьком островке Малайского архипелага. Рассматривая джунгли в сумерки в полевой бинокль, он принял орхидеи за белых ночных бабочек. В память о своей ошибке Блюме назвал род Phalaenopsis, что означает «мотыльковоподобный» (греч. Phalania — «ночная бабочка», opsis — «сходство»).

1.6 Проблема охраны исчезающих видов.

Места обитания всех видов Фаленопсисов находятся под сильным давлением человека. Во всех местах их обитания продолжается уничтожение тропических лесов и превращение их в сельскохозяйственные угодия. Чрезмерный сбор растений для экспорта с целью удовлетворения спроса со стороны коллекционеров орхидей подрывает численность видов произрастающих в еще сохранившихся естественных местообитаниях. Некоторые виды Фаленопсисов в настоящее время известны только по описаниям сделанным более 100 лет назад.

Чтобы защитить растения, были приняты правила, регулирующие торговлю. Все виды рода Фаленопсис входят в Приложение II Конвенции CITES. Цель Конвенции состоит в том, чтобы гарантировать, что международная торговля дикими животными и растениями не создаёт угрозы их выживанию. Реальная проблема заключается не в торговле растениями, а в разрушении естественной среды обитания в местах их произрастания.

1. Размножение растений.

В природе существует два типа размножения: вегетативное и генеративное. Генеративное размножение включает в себя: бесполое размножение; половое воспроизведение и половое размножение; семенное размножение.

Табл.2. Сравнительная характеристика типов размножения растений

Тип размножения	Генетическая основа	Основополагающие процессы	Типы диаспор (т.е. зачатков новых особей)
Вегетативное	Исходная плоидность сохраняется.	Регенерация.	Фрагменты вегетативных органов, выводковые тела и почки.
Генеративное: а) бесполое размножение; б) половое воспроизведение и половое размножение; в) семенное размножение.	Двукратное изменение плоидности в ходе жизненного цикла.	Мейоз (бесполое), Половой процесс (половое).	Мейоспоры, гаметы, семена и плоды.

Бесполое размножение отличается от вегетативного тем, что при вегетативном размножении дочерняя особь, генетически идентичная материнской (клон), обязательно получает фрагмент материнского организма, так как образуется из него; при бесполом размножении же этого не происходит.

В основе генеративного размножения лежит чередование двух ядерных фаз — гаплоидной и диплоидной. Это чередование обусловлено двумя альтернативными процессами — оплодотворением и редукционным делением (мейозом). У растений гаплоидная фаза, образующая гаплоидные гаметы, называется гаметофитом, а диплоидная фаза, формирующая гаплоидные споры, из которых развиваются гаметофиты, — спорофитом. Спорофит и гаметофит могут как отличаться друг от друга морфологически (гетероморфный жизненный цикл), так и быть одинакового строения (изоморфный жизненный цикл).

Отличие полового размножения от полового воспроизведения заключается в том, что в первом случае на гаметофите формируется единственный зародыш спорофита, а во втором — несколько. У большинства растений происходит половое воспроизведение.

Вегетативное размножение в свою очередь различается у двух подцарств. Подцарство низшие растения (водоросли) и подцарство высшие растения.

У водорослей вегетативное размножение осуществляется тремя основными способами:

• Делением одноклеточных организмов;

• Митоспорами (неподвижными апланоспорами и подвижными зооспорами);

• Специализированными структурами.

А у высших растений выделяют три основных способа вегетативного размножения:

• Партикуляция;

• Сарментация;

• Вегетативная диаспория.

2.1 Микроклональное размножение

К вегетативному размножению относят ещё один способ, который на данном этапе развития науки является актуальным. Этот способ – это микроклональное размножение растений.

Микроклональное размножение (клональное микроразмножение) – это массовое бесполое размножение растений в культуре клеток и тканей, при котором возникшие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру (Тимофеева, 1989).

Согласно книге Батыгиной Т.Б. и Васильевой В.Е. «Размножение растений». Культура ткани — это один из биотехнологических приемов, используемых для коренного массового размножения и получения лекарственного сырья payвольфии рвотной, которая является продуцентом противоаритмических и гипотензивных препаратов.

Этот метод включает изоляцию эксплантов из листовой ткани, посадку стерильных эксплантов на питательную среду для каллусообразования, перенос каллуса на среду для индукции растений.

Основоположником клонального микроразмножения является французский учёный Жорж Морель, который в 1960 г. Разрабатывал этот метод для орхидей. Он использовал верхушку цимбидиума, один из представителей сем. Орхидные, которая состояла из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которых при определенных условиях появлялись сферических образования – протокормы.

2.1.1 Типы клонального микроразмножения.

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de-novo:

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

В действительности клональное микроразмножение можно производить разными способами. Основные типы клонального микроразмножения:

• Подавление апикального доминирования и развитие пазушных почек;

• Микрочеренкование;

• Образование микроклубней, микролуковиц:

• Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;

• Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или эмбриоидогенеза.

Массовое производство каллуса с последующим образованием побегов можно было бы считать идеальным методом крупномасштабного размножения, однако в настоящее время существует два серьезных недостатка, ограничивающих использование этого подхода. Способность многих каллусов регенерировать побеги снижается или даже теряется в процессе культивирования и пересадок каллусной ткани. В то же время постепенно возрастает число полиплоидных, анеуплоидных и других генетически измененных клеток, а, следовательно, и вероятность образования из каллуса растений, отличающихся от исходной родительской формы.

2.1.2 Преимущества клонального микроразмножения

Основные преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами размножения растений:

• Получение генетически однородного посадочного материала;

• Оздоровление растений от грибных и бактериальных патогенов, вирусных, микроплазменных и нематодных инфекций;

• Высокий коэффициент размножения;

• Сокращение продолжительности селекционного процесса;

• Возможность доставки и легкость транспортировки;

• Размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

• Возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала.

Клональное микроразмножение используют:

• Для быстрого получения больших количеств заведомо безвирусного материала;

• В селекции для поддержания и размножения небольшого числа отдельных генотипов;

• Для быстрого размножения новых выведенных сортов;

• Для размножения древесных растений, разведение и селекция которых осуществляется медленно вследствие длительности или отсутствия вегетативного размножения;

• Для поддержания гетерозисных гибридов или других гетерозигот, расщепляющихся при скрещивании растений;

• Для сохранения редких и исчезающих видов;

2.1.3 Этапы клонального микроразмножения.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2^оС, +10^оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Стоит заметить, что химический состав питательной среды, и её физические свойства должны соответствовать тем задачам, которые выполняет среда на каждом этапе микроразмножения.

Добавление активированного угля благотворно сказывается на росте побегов. Активированный уголь адсорбирует выделяемые эксплантом токсические вещества. В то же время уголь адсорбирует из среды и биологически активные вещества, что существенно уменьшает их исходную концентрацию.

Для большинства растений в качестве субстратов используют смеси в соотношениях: торф: песок (3:1); торф : дерновая земля : перлит (1:1:1); торф : песок : перлит (1:1:1).

Пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты, заполняют заранее приготовленным почвенным субстратом.

Известно, что при культивировании побегов относительная влажность воздуха в сосуде достигает 100%. Поэтому основная задача акклиматизации ex-vitro регенерированных растений – это создание относительно высокой влажности воздуха в первые дни после пересадки, поскольку значительные потери воды могут привести к гибели микроклонов. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in-vitro, во время их пересадки в полевые условия: листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%_-ным водным раствором глицерина или смесью парафина (жира) и диэтилового эфира (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100% выживаемость.

Через 20 – 30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают солями Кнудсона, Мурасиге и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста микроклонов их рассаживают в большие ёмкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания данного вида растений.

Факторы, влияющие на эффективность клонального микроразмножения:

• Генетические и физиологические факторы.

• Гормональные факторы.

• Физические факторы.

• Технические трудности клонального микроразмножения.

2.1.4 Проблемы и перспективы клонального микроразмножения:

Зачастую растения, размножаемые методами культуры тканей, не всегда аналогичны исходным материнским формам. Это может быть вызвано рядом причин, которые относятся двум категориями:

1) кратковременные изменения в развитии, так называемые эпигенетические эффекты;

2) генетические изменения, возникающие в результате генных или хромосомных мутаций.

Таким образом, в настоящее время для обеспечения генетически однородных проростков предпочтительным методом размножения in-vitro является размножение пазушными побегами. Лаборатории, занимающиеся микроразмножением, по возможности используют именно этот метод, и поэтому без особых трудностей получают генетически однородный посадочный материал.

2.1.5 Введение в культуру использованием различных типов эксплантов.

Приемы семенного размножения и культивирования растений в условиях in-vitro рассматриваются как один из перспективных способов сохранения биологического разнообразия представителей семейства Orchidaceae. Работы в этом направлении, в том числе по орхидным умеренных широт, немногочисленны.

В настоящее время имеются данные по различным аспектам эмбриогенеза и постсеменного развития некоторых нетропических видов (Батыгина, 1983; Андронова, 1988, 1999), выявлены особенности строения семян, определяющие их всхожесть и жизнеспособность на искусственных питательных средах (Куликов, Филиппов, 1991, 1996, 1998), показаны асинхронность развития протокормов и растений in-vitro (Андронова, и др., 2007) и возможность их использования для реинтродукции и изучения последующего развития в природных условиях (Андронова, Ивасенко, 2007; Андронова, и др.,2007).

В ходе экспериментов использовали различные типы эксплантов׃ листья, верхнюю и среднюю части листовой пластинки с центральной жилкой и без нее, ткани стебля, пыльников, листочков околоцветника.

Для получения асептических эксплантов использовали двойной режим стерилизации с 80 % этиловым спиртом и 15 % перекисью водорода в течение 1,5 и 2 мин. соответственно.

Для культивирования эксплантов Epipactis helleborine (L.) Crantz.C Шейко Е. А. и Мусатенко Л.И. использовали питательную среду, содержащую макро-, микросоли по Мурасиге-Скуге (МС) (30 мг/л сахарозы, 7 г/л агара) с добавлением 6-БАП, 2,4-Д, ИМК.

Перед автоклавированием рН среды доводили до 5,6–5,9. Экспланты из листьев и из листочков околоцветника культивировали в темноте при 25±1 С, сегменты стеблей и пыльники – на свету при 10^-ти часовом освещении интенсивностью 1,5–2 тыс. Лк и относительной влажности воздуха 60% и температуре 25±1ºС.

При использовании листьев и стеблей большое количество эксплантов подверглось некрозу и оказалось мало жизнеспособным. Культивирование листочков околоцветника Epipactis helleborine не дало положительных результатов.

Каллус они получили при введении в культуру in-vitro пыльников, что было обусловлено их высоким морфогенетическим потенциалом и определенной автономностью от материнского растения.

В процессе введения этих эксплантов в культуру происходило переключение программы компетентных клеток генеративных структур с обычного гаметофитного пути на иной путь – спорофитный, в результате чего наблюдали образование растения-регенеранта.

Для характеристики каллуса, образовавшегося в культуре изолированных пыльников, предложено использовать термин «андроклинный каллус» (Круглова, 2009). Широко распространенный термин «андрогенный каллус» не вполне приемлем, поскольку, как справедливо полагает Тырнов (2005), необходимо различать понятия «андрогенез in-vitro» и собственно «андрогенез» (Круглова, Дубровная, 2011).

Полученный андроклинный каллус E. helleborine в дальнейшем может развиваться по следующему пути: непрямой эмбриоидогенез – формирование эмбриоида, гемморизогенез – формирование почки и корня, геммогенез – формирование тканей (Konieczny et al., 2003; Rodrigues et al., 2004).

Рассматриваемая ситуация усложняется тем, что сами каллусные клетки, способные к развитию по определенному пути морфогенеза in-vitro, с формированием органов, зародышеподобных структур или тканей, берут начало от одной клетки – микроспоры или клетки пыльцевого зерна. Более того, в зависимости от условий культивирования (главным образом, от фитогормонального состава индукционной питательной среды) микроспора может развиваться не только по пути формирования каллуса, но и альтернативно – по пути формирования эмбриоида непосредственно (прямой эмбриоидогенез) (Круглова и др., 2005).

В полученном ими андроклинном каллусе были обнаружены мелкие клетки, локализованные группами, с крупными ядрами, образующими меристематический очаг. Появление меристематических очагов означало, что в каллусной ткани начались процессы дедифференциации.

1. Методики изготовления среды.

2.1.6.1 Среда Мурасиге-Скуга Туровской (1962) – Микроразмножение груши (Садоводство, 1987, 6, с. 22-24).

Состав среды прототипа следующий, мг/л:

• Макросоли: NH₄NO₃ – 1650; KNO₃ – 1900; KH₂PO₄ – 170; MgSO₄*7H₂O – 370.

• CaCl₂*2H₂O – 440.

• Микросоли: NaMoO₄*7H₂O - 0,25; H₃BO₃ - 6,2; MnSO₄*4H₂O – 22,3; ZnSO₄*7H₂O - 8,6; KI - 0,83; CuSO₄*5H₂O - 0,025; CoCl₂*6H₂O - 0,025.

• Хелат железа: FeSO₄*7H₂O - 27,8; Na₂ЭДТА - 37,3.

• Витамины и органические соединения: Тиамин хлорид - 0,2; Пиридоксин хлорид - 0,54; Никотиновая кислота - 0,5; Аскорбиновая кислота - 1,5; Мезоинозит – 100; 6-БАП - 1,0; Настойка лимонника (капли) - 15 – 30; Сахароза – 30000; Агар – 5000; Вода – Остальное.

Недостатками известной среды являются сравнительно длительный период размножения, дороговизна используемых стимуляторов роста.

2.1.6.2 Среды Т.М. Черевченко и Г.П. Кушнир – Микроразмножение орхидей (Орхидеи в культуре, 1986, с. 84-87).

1. Среда Хеллера:

KCl – 750

NaNO₃ – 600

MgSO₄ *7H₂O – 250

MnSO₄*4H₂O – 0,1

NaH₂PO₄*H₂O – 125

FeCl₃*6H₂O – 1

ZnSO₄*7H₂O – 1

H₃BO₃ – 1

CuSO₄*5H₂O – 0,03

AlCl₃ – 0,03

NiCl₂*6H₂O – 0,03

KJ – 0,01

Сахароза - 20000

рН 5,6-5,8

Рекомендуется для выращивания тканей многих видов орхидей.

1. Среда Томпсона:

Мочевина – 540

(NH₄)₂HPO₄ – 345

Mg SO₄*7H₂O – 369

FeSO₄ – 25

Уксуснокислый кальций – 79

Уксуснокислый калий – 392

Na₂ЭДТА – 37

MnCl₂ – 2,2

CuSO₄ – 0,23

ZnSO₄ – 0,29

H₃BO₃ – 1,86

NH₄MoO₄ – 0,035

Сахароза – 30000

рН 5,6

Рекомендуется для эпифитных и наземных видов орхидей.

1. Среда Мореля:

(NH₄)₂NO₃ –1000

Ca(NO₃)₂*4H₂O – 500

KCl – 1000

MgSO₄*7H₂O – 125

KH₂PO₄ – 125

Микроэлементы по Хеллеру – 1 мл

Гомогенат банана – 40000

Сахароза – 20000

рН 5,5-5,6

Применяется для размножения протокормов цимбидиума, каттлеи, дендробиума, ванды, мильтонии и других орхидей.

1. Среда Вацина и Вента:

KH₂PO₄ -250

Ca₃(PO₄)₂ -200

Сахароза – 20000

(NH₄)₂SO₄ – 500

Винокислое железо – 28

Mg SO₄*7H₂O – 250

MnSO₄*7 H₂O – 7,5

KNO₃ – 525

рН 5,6

Рекомендуется для тканей цимбидиума, каттлеи, фаленопсиса и ванды.

1. Среда Кнопа:

Лимоннокислое железо – 10

Транскоричная кислота – 14,8

L-Изолейцин – 13,2

Тиамин – HCl – 0,4

БАП – 0,2

Мезоинозит – 100

Сахароза – 20000

Ca(NO₃)₂*4 H₂O –500

KNO₃ – 125

MgSO₄* 7 H₂O – 125

KH₂PO₄ – 125

H₃BO₄ – 0,056

MoO₃ – 0,016

CuSO₄ – 0,040

ZnSO₄*7 H₂O – 0,033

pH 5,0-5,5

Используется для почек цветоносов фаленопсиса.

2.1.7 Влияние факторов питательной среды на оптимизацию процесса прорастания семян.

Методы in-vitro с использованием питательных сред позволяют преодолеть трудности, связанные с проращиванием семян и подращиванием сеянцев орхидных. Однако в условиях оранжерей сеянцы тропических и субтропических орхидей вступают в генеративную фазу лишь через 5 - 8 лет после прорастания семян.

Рассмотрим влияние факторов питательной среды на оптимизацию процесса прорастания семян согласно Н. А. Астапенко.

Материалом исследований служили семена из зрелых плодов Cephalanthera damosonium (Mill.) Druce. В качестве стерилизующего агента использовали 3 % перекись водорода, выдерживая в ней семена в течение 3 суток перед посадкой.

После обработки семена промывали стерильной дистиллированной водой. В исследованиях использовали три варианта среды Кнудсона и модификацию среды FN. Модифицированные среды Кнудсона содержали гумат натрия (50 мл/л), активированный уголь (1 г/л) и различались по концентрации сахарозы (Кнудсон С – 20 г/л, Кнудсон С-1 – 10 г/л, Кнудсон С-2 – 50 г/л).

Культивирование семян проводили в культуральных сосудах в термостате с температурой +20 – +25°С, а затем в фитолюминистате ФСЛ-В с освещением 1-3 тыс. люкс при температуре +20 – +25 °С с фотопериодом 16 часов.

Табл.3. Компоненты используемых вариантов питательных сред.

Компонент среды	Питательная среда
	Кнудсон С	Кнудсон С-1	Кнудсон С-2	FN-мод.
Ca(NO3)2*4H2O	1000 мг/л			44 мг/л
(NH4)2SO4	500 мг/л			–
KH2PO4	250 мг/л			20 мг/л
MgSO4*7 H2O	250 мг/л			20 мг/л
FeSO4*7 H2O	27,8 мг/л			14 мг/л
MnSO4*4 H2O	7,5 мг/л			–
Гумат натрия	–	50 мг/л		–
Активированный уголь	–
Сахароза	20000 мг/л	10000 мг/л	50000 мг/л	1000 мг/л
Агар	8000 мг/л
NH4NO3	–			40 мг/л
KCl	–			20 мг/л
Трилон «Б»	–			19 мг/л
Гидролизат казеина	–			700 мг/л
Сухой дрожжевой экстрат	–			800 мг/л

Чтобы оценить влияние исследуемых факторов оптимизации питательной среды на скорость прорастания семян, каждые сутки, начиная с первых суток культивирования, семена отбирали для приготовления временных препаратов. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по общепринятым методам.

Полученные в результате эксперимента данные показывают, что концентрация сахарозы в питательной среде оказывает существенное влияние на скорость прорастания семян, т. е. на время наступления определенного этапа прорастания и его протяженность.

Табл.4.Влияние концентрации сахарозы на скорость прорастания семян (количество набухших семян от общего количества высеянных на среду, в %).

Вариант питательной среды	Сутки культивирования
	2	5	10	15	20	25
Кнудсон С	10%	25%	35%	50%	70%	100%
Кнудсон С-1	10%	25%	50%	100%
Кнудсон С-2	2%	5%	7%	10%	15%	15%
FN-мод.	10%	25%	50%	70%	100%

Рассуждая о влиянии сахарозы различных концентраций на прорастание семян, автор пришёл к выводу о том, что среда Кнудсон С-1, т.о., обеспечивала высокую скорость прорастания за короткий промежуток времени. Так, уже на 7 – 10 сутки культивирования набухало 50 % семян, а на 15 сутки происходило формирование протокормов. Наимение удобный вариант для культивирования - Кнудсон С-2, т.к., всхожесть семян составила 30%, и на прорастание было затрачено больше времени. Отсюда следует вывод, что для изготовления среды наибольший приоритет принадлежит среде Кнудсон С-1, если же не будет такой возможности то, использовать среду FN- мод., и среду Кнудсон С. В редком случае советуют использовать среду Кнудсон С-2.

Также на онтогенез представителей орхидных влияют неорганические компоненты среды МС. Так при варьировании концентрации минеральной основы среды выявлено, что рост побегов был максимальным на полной среде, а корнеобразование и формирование псевдобульб – на 1/2 среды МС (Труды Карельского научного центра РАН № 3 - Е. В. Фатеева, Е. В. Мокшин, А. С. Лукаткин, год 2013).

В культуре in-vitro Е. В. Фатеева, Е. В. Мокшин, А. С. Лукаткин изучали влияние концентрации минеральной основы среды Мурасиге-Скуга (МС) и регуляторов роста (РР) – синтетических аналогов цитокининов (кинетина, 6-бензиламинопурина (6-БАП), тидиазурона) и ауксина (индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)) – на органогенез цимбидиума гибридного.

При варьировании концентрации минеральной основы среды выявлено, что рост побегов был максимальным на полной среде, а корнеобразование и формирование псевдобульб – на 1/2 среды МС.

При исследовании влияния различных препаратов цитокининового типа в сочетании с ауксиновым препаратом на органогенез цимбидиума показано лучшее формирование псевдобульб в вариантах с использованием 2,5 мг/л кинетина + 0,5 мг/л ИУК (по количеству) и 0,1 мг/л кинетина + 0,5 мг/л ИУК (по размеру псевдобульб). Количество формирующихся побегов было максимальным на среде с внесением 10^-4 моль/л тидиазурона + 0,5 мг/л ИУК, тогда как побеги максимальной длины формировались в варианте с добавлением 6-БАП +ИУК (по 0,5 мг/л каждый).

Однако сведения по влиянию регуляторов роста на каллусогенез и органогенез орхидных и выбор оптимальных концентраций довольно противоречивы. Очевидно, что для каждого вида нужно подбирать индивидуальные параметры состава питательной среды, регуляторов роста и др. В связи с этим можно предположить, что применение регуляторов роста будет неодинаково интенсивно стимулировать рост побегов и размножение у цимбидиума.

Для клонального микроразмножения использовали псевдобульбы, а также части побегов. Экспланты высаживали на питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую различные концентрации регуляторов роста: 6-БАП (0.1–4.0 мг/л), Рибав-Экстра (10-2–10-7%); для сравнения использовали вариант без регуляторов роста.

Более высокие и низкие дозы регулятора в среде приводили к существенному замедлению процессов роста, в результате длина побегов достоверно не отличалась от варианта без регулятора.

Использование природного регулятора Рибав-Экстра показало, что этот препарат не индуцировал обильного образования псевдобульб по сравнению с вариантом без регулятора, а при концентрациях 10-3–10-4% они образовывались в совсем малых количествах.

Малые концентрации в меньшей степени стимулировали рост побегов. Активация ростовых процессов цимбидиума при действии данного регулятора обусловлена тем, что в состав препарата входит смесь аминокислот, которые включаются в синтез белков, регулирующих процессы роста и развития проростков, а также ряд биологически активных соединений, влияющих на деление клеток и рост органов.

Сравнение показало, что рост побегов был максимальным при использовании препарата Рибав-Экстра, за которым следовали 6-БАП.

В ходе проведенных опытов по влиянию регуляторов роста на органогенез и рост Cymbidium hybridum hort. «Memoria Amelia Earhart» в культуре in-vitro выявлен положительный эффект применения данных препаратов в определенных концентрациях:

1) применение препарата Рибав-Экстра в концентрации 10-4% способствовало интенсивному росту побегов у цимбидиума;

2) 6-БАП стимулировал рост побегов цимбидиума, особенно при концентрациях 1.0 и 3.0 мг/л.

2.1.8 Начальные этапы роста и развития в культуре in-vitro.

Для посева использовали незрелые семена Пальчатокоренник мясо-красный (Dactylorhiza incarnatа), которые были собраны с разных экземпляров. Семена в коробочках слегка слипались друг с другом, имели белую окраску с бежевым оттенком.

Посевы проводили в ламинарном боксе на питательную среду Кнудсона с активированным углем, гуматом натрия (Черевченко, Кушнир, 1986) и микроэлементами. Неповрежденные коробочки стерилизовали в течение 15 минут в 20% растворе хлорамина, с последующей четырехкратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Плоды раскрывали стерильными инструментами над питательной средой и равномерно распределяли семена по ее поверхности.

До появления побега сеянцы находились в темноте, после – их помещали в климатическую камеру с фотопериодом 12 часов. Температура культивирования составляла 22 – 24°С. Пересадку сеянцев проводили через 8 месяцев после посева семян на питательную среду. Морфометрические параметры определяли дважды: через 8 месяцев культивирования (измеряли линейные размеры протокорма), через 15 месяцев – длины побега и корня.

Установлено, что через месяц после посева на питательную среду семена D. Incarnatа меняют окраску с белой на светло-зеленую и набухают, очевидно, вследствие увеличения размеров зародыша.

Появляющиеся всходы на начальных стадиях роста практически не различаются по размерам. Их заметный рост наблюдается в течение последующих двух месяцев. Всасывающие волоски становятся хорошо различимы на развивающихся растениях в начале четвертого месяца культивирования.

На 8 месяц культивирования сеянцы D. incarnata представляли собой бесхлорофилльные образования различной формы. Они были распределены Сидоровым А. В. и Маракаевым О. А. по четырем морфологическим типам – каплевидные, шаровидные, веретеновидные и эллипсовидные, соотношение которых составляло 3:2:2:1.

Для крупных отмечены высокие темпы роста: их длина и ширина более чем в 2 раза превышают соответствующие показатели для мелких экземпляров. Длина является наиболее вариабельным признаком, чем ширина. При этом у второй группы сеянцев коэффициент вариации морфометрических параметров выше по сравнению с первой.

Интересно, что наибольшие размеры были характерны для экземпляров каплевидной формы. На них же была отмечена почка в виде бугорка на апикальной части, что свидетельствует о более высоких темпах их развития. После завершения роста в длину сеянцы некоторое время растут в толщину, затем начинает вытягиваться побег.

Отмечено, что растения с низкими показателями роста формировались из скученно расположенных на питательной среде мелких сеянцев эллипсовидной, веретеновидной и шаровидной форм. Средняя длина их корня на 35% превышала среднюю длину побега. Растения второй группы формировались из крупных сеянцев, преимущественно каплевидной формы. Соотношение степени развития их побега и корня отличалось от такового для растений первой группы. Наибольшие размеры были характерны для побега этих растений, средняя длина которого на 10% превышала среднюю длину корня.

Это приводит к тому, что семенное потомство одного и того же года репродукции, оказывается способным переходить в следующее возрастное состояние в разные годы вегетации. Это особенно важно для осуществления возобновления и поддержания естественных ценопопуляций, так как благодаря неравномерному росту и развитию создается банк проростков. В связи с чем, гетерогенность по темпам роста молодых растений, вероятно, можно рассматривать как адаптивную характеристику исследуемого вида.

В культуре in-vitro разница размеров сеянцев отчасти может быть обусловлена их локализацией относительно друг друга, а также степенью соприкосновения всасывающих волосков с питательной средой.

Было отмечено, что мелкие экземпляры располагались на питательной среде скученными группами, их всасывающие волоски переплетались друг с другом и часто не достигали поверхности среды. Крупные сеянцы находились на питательной среде одиночно, их всасывающие волоски закреплялись в ней. Независимо от темпов роста побегов и корней через 15 месяцев культивирования были получены растения с достаточно развитой системой органов.

Таким образом, представленные в работе данные свидетельствуют о неравномерном росте и развитии семенного потомства D. incarnata в культуре in-vitro. Выявленные различия, возможно, связаны с генетической гетерогенностью семян, использованных в работе, и демонстрируют адаптационные способности вида к условиям произрастания. Показано, что форма сеянцев на ранних этапах развития связана с их размерами, расположением на питательной среде и степенью контакта с ней. Через 15 месяцев культивирования in-vitro возможно получение развитых экземпляров D. incarnata, имеющих корень и побег.

2.1.9 Особенности адаптации регенерантов к условиям ex-vitro.

Как и говорилось ранее, одним из способов сохранения редких видов является получение большого числа растений в культуре in-vitro и их реинтродукция на территории Ботанических садов и в природные растительные сообщества. Но актуальной проблемой по прежнему остается адаптация регенерантов к условиям ex-vitro, как в горшечной культуре, так и произрастанию в открытом грунте.

В настоящее время известны примеры проведения такой работы для некоторых видов орхидных, однако они немногочисленны, и сведения о результатах таких работ очень ограничены (Batygina, Makoveychuk, 1994, Steward, 1998, Ramsay, Steward, 1998, Ramsay, Dixon, 2003, Batygina, Bragina, 2007).

Было показано, что способ высадки и выбор места для заложения площадок являются важными факторами определяющими процент выживающих растений (Андронова и др, 2007; Андронова, Ивасенко, 2007 а,б). Кроме них, причиной высокой гибели экспериментальных растений в природных условиях могут быть структурные и физиологические особенности, которые определяются условиями культивирования in-vitro (отсутствие сезонности развития, возможность получения питательных веществ из искусственной среды и т.п.). Данная проблема до настоящего времени не разрабатывалась.

Т. о., можно заключить, что внучатый тубероид может отсутствовать у особей в момент высадки, но он сформируется у них уже после нее. Однако, вероятно, неправильно рассматривать, что особи беззачатков тубероида являются более уязвимыми в новых для них условиях существования, как признак единственный и основной, контролирующий жизнеспособность и процент выживания особей после их пересадки в природные условия.

Все изученные экспериментальные растения имели моноподиальный тип нарастания побега. Начиная со второго после высадки года, у некоторых особей отмечен переход к симподиальному типу нарастания побега. Однако это наблюдалось у менее, чем у половины изученных растений. Следовательно, у некоторых экспериментальных растений моноподиальный тип нарастания побега сохранялся необычно долго.

Условия в культивационных ёмкостях приводят к формированию растений, имеющих нарушения в анатомическом строении листа и развитии устьичного аппарата, что вызывает нарушение водного статуса, и, зачастую, приводит почти к 100 % гибели растений в оранжерейных или полевых условиях.

Сеянцы и клонированные растения выращивали в конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл. Ёмкости с растениями размещали в культуральном помещении на стеклянных стеллажах при искусственном освещении интенсивностью 2000 Лк, фотопериод 12 ч, температура 22-26⁰С, влажность 70%.

В работе авторы использовали наиболее употребляемые для культивирования орхидных агаризированные питательные среды на основе прописей Кнудсона (КПГУ) и Мурасиге-Скуга (МС) с минимумом регуляторов роста и физиологически активных веществ.

При посеве семян на агаризированные питательные среды первые признаки прорастания (набухание семян), нами были отмечены на 45-е сутки после посева. Ещё через 15-20 дней зародыши стали приобретать зелёный цвет.

Формирование первых протокормов E. Barbata было зафиксировано на 102 сутки. В возрасте 150 дней на апикальной части протокормов были отмечены чётко обособленные верхушечные точки роста, которые начали формирование первых листьев.

Образование первых корней у сеянцев Eryodes barbata происходило практически одновременно с развитием побега. На наиболее развитых экземплярах в ходе визуальных наблюдений образование первых корней было отмечено на 160 сутки.

В возрасте 720 суток первая партия растений была передана для адаптации в оранжерейные условия. При этом, у каждого сеянца в среднем было по два хорошо развитых фотосинтезирующих листа и по 2 корня, высота растений в среднем составляла около 30 мм.

Т. о., исследования Т. М. Черевченко, Л. И. Буюн и Р. В. Иванникова показали, что при перенесении из культуры in-vitro в оранжерейные условия листья ювенильных растений E. barbata имеют строение поверхности, типичное для взрослых растений, что может свидетельствовать об адекватной технологии размножения и культивирования растений in-vitro.

В качестве приема, повышающего эффективность акклиматизации размноженных in-vitro растений к условиям оранжерейной культуры, было использовано постепенное понижение влажности воздуха в оранжерее.

На основе вышеперечисленных данных. Была составлена методика микроклонального размножения Орхидеи Фаленопсис.

Методика

В качестве модельного объекта было выбрано растение рода Фаленопсис (Phalaenopsis Sp.)

В in-vitro используются апексы верхушечных и боковых почек (точек роста), кончиков корней (особенно проростков). Апикальная меристема — группа меристематических (образовательных) клеток, организованных в ростовой центр, занимающая терминальное положение в побеге или корне и обеспечивающая образование всех органов и первичных тканей. Верхняя часть апикальной меристемы представлена инициалями (единственной клеткой у хвощей и многих папоротников и многоклеточной структурой у семенных растений). Ближайшие производные инициальных клеток часто выделяют в зону протомеристемы. Вслед за ней лежат ткани, уже частично дифференцированные, но всё ещё находящиеся в меристематическом состоянии, которые относят к частично детерминированной первичной меристеме. В зависимости от производимых ею систем тканей детерминированная меристема включает следующие клеточные комплексы: тунику, образющую в дальнейшем первичную покровную ткань (эпидермис) и часть первичной коры, и корпус, клетки которого постепенно формируют комплекс проводящих тканей (центральный цилиндр); в корне — дерматоген, дифференцирующийся в первичную покровную ткань (ризодермис); периблему — будущую первичную кору; плерому — центральный цилиндр. Таким образом, будущий ход развития меристематических тканей частично детерминирован уже самим размещением их в апексе побега и корня.

1. Введение растений в культуру.

В качестве эксплантов на данном этапе работ использовались молодые листья и цветочные почки. В дальнейшем планируется ввести растения в культуру in-vitro также семенами.

Отбирали и промыли посадочный материал, для удаления частиц почвы и прочих загрязнений с листовых пластинок.

После помещение посадочного материала в специальные кассеты, их промывали под струёй тёплой воды (30^о С) 40 минут и периодически перемешивая сосуд с касетами. Затем контейнеры с посадочным материалом помещали в раствор ПАВ (хозяйственного мыла) с встряхиванием в шейкере 25 минут.

После чего кассеты промывали стерильной водой. Затем помещали в стакан со 70% спиртом периодически помешивая. Для эксперимента часть посадочного материала помещали в 2,5% раствор гипохлорита натрия периодически помешивая, объекты находились в растворе 5 мин. Другую половину мы помещали в 2% раствор средства «3D-септа» на 15 минут.

Средство «3D-Септ» представляет собой состав общего стерилизующего действия, сочетает противовирусные и антимикробные свойства. В состав в качестве действующих веществ (ДВ) входит алкилдиметилбензиламмония хлорид (ЧАС) – 8,5%, дидецилдиметиламмония хлорид (ЧАС) – 4%, а также неионогенные поверхностно-активные вещества и натуральные терпеновые масла цитрусовых растений. рН 1% водного раствора средства 7,0.

После чего кассеты с материалами промывали в трёх порциях стерильной воды время от времени помешивая.

Подробно последовательность и продолжительность этапов обработки представлена в табл. 4.

Табл. 4. Последовательность и продолжительность этапов обработки.

Исходный материал	ПАВ (мин)	С2Н5ОН 70% (сек)	NaClO 10% (мин)	Н2О2 10% (мин)	Промывка стер. водой
Молодые листья	20	20-30	10	5
Цветочные почки	20	40-60	10-15	2
Туберидий	20	60-90	20	10

П оследующие действия проводились в ламинар-баксе. Перед началом работы У.Ф. лампы и вентиляторы включали за 30 минут до начала работ в ламинар-боксе. Далее следовала подготовка рабочего места: обработка рабочего места 75% спиртом, расставили материалы и оборудование на рабочий стол, как показано на рис. 1.

Далее следовала посадка стерильного материала в пробирки и колбы со средой.

После посадки материала, ватно-марлевые пробки колб и пробирок закрывали кусочками целлофана, зафиксировав их серными резинками. Подписали CD – маркером число высадки, инициалы оператора и наименование культуры.

Разместили пробирки в штативы, в шахматном порядке, чтобы хорошо попадал свет, и перенесли в светоустановку,

Дальнейшее культивирование производилось с фотопериодом 14-16 часов и освещенностью около 5 кЛк.

Выбраковку проводить через 3-4 недели.

1. Состав стандартной среды МС.

В среде МС для Фаленопсиса (Phalaenopsis Sp.) использовался состав стандартной среды МС на 0,5 л. С добавлением 1г на пол-литра активированного угля. Использовалось 0.5 литра среды МС табл.5.

Табл. 5. Состав стандартной среды МС.

Компоненты	Среда, мг/л	Маточный раствор	Количество маточного раствора на 1л среды, мл
Макросоли, г/л маточного раствора
NH4NO3	1650	33	50
KN03	1900	38
КН2РО4	170	3,4
MgS04*7H20	370	7,4
Кальций, г/200 мл маточного раствора
СаС12	440	8,8	10
3. Микросоли, мг/100 мл маточного раствора
Na2Mo04*2H20	0,25	25	1
Н3ВО3	6,2	620
MnS04*4H20	22,3	2230
ZnS04*7H20	8,6	860
KJ	0,83	83
CuS04*5H20	0,025	2,5
CoCl2*6H20	0,025	2,5
Хелат железа, г/л маточного раствора
FeS04*7H20		5,57	5
Nа2ЭДТА*2Н20		7,45
Витамины и органические соединения
Тиамин	0,1		Витамины и органические соединения вводить в день приготовления среды (рН=5,6-5,8)
Пиридоксин	0,5
Никотиновая кислота	0,5
Мезоинезит	100
Глицин	2
ИУК	В зависимости от экспланта
Кинетин	0,2
Сахароза г/л	30
Агар г/л	7

Следует отметить, что ткани фаленопсиса выделяют фенольные соединения, которые диффундируют в среду, после чего ткань быстро темнеет и отмирает. Поэтому многие авторы советуют пассировать ткани каждые 10 дней. Предотвратить частые пересадки помогает добавление к среде активированного угля, который адсорбирует токсические выделения. Кроме того, листья следует не разрезать на сегменты, а осторожно отрывать для уменьшения раневой поверхности и целые пластинки листа укладывать на среду МС с 0,1 мг/л кинетина и 0,1 мг/л НУК.

1. Приготовление и использование цитокининовой пасты.

Для стимулирования образования адвентивных точек роста часто используют гормональные пасты. Они препятствуют распространению фитогормона по всему объему среды, и действуют локально. Пасты содержащие цитокинин производятся промышленностью, но также можно приготовить в лаборатории.

Растворяли навеску цитокинина в минимально возможном количестве этилового спирта (96), до получения однородного раствора или мелкой взвеси, из расчета 10мг на 1мл пасты.

Расплавили ланолин или вазелин в маленьком бюксе на магнитной мешалке с нагревателем или погружая емкость в горячую воду, при температуре около 45-50^оС, влили концентрат цитокинина и тщательно промешали.

Автоклавировали стандартным методом в вертикальном бюксе, закрытом ватно-марлевой пробкой, и завернутым в бумагу (необходимо т.к. весь этанол должен испариться). Стеклянную крышку от бюкса автоклавировали в отдельной упаковке (она будет нужна чтобы закрыть бюкс после стерилизации).

Сделали из жесткой стальной проволоки аналог микробиологической петли с диаметром отверстия около 1,5мм. Проколили до ручки в пламени спиртовки, остудить о стенку сосуда с пастой, и взять еще теплой петлей, поворачивая ее, шарик пасты.

Нанесли на поверхность экспланта шарик пасты, и проколоть насквозь стерильной медицинской иглой, частично нарушив покровы экспланта.

Эксплант поместили на поверхность среды, чтобы цитокинновая паста осталась на границе сред. Выращивать зеленые экспланты при стандартных условиях.

Заключение

1) Подробный анализ источников показал, что методика МКР популярна и применяется для выращивания растений, которые плохо поддаются размножению другими способами. Также этот метод незаменим, если необходимо постоянно получать в достаточно короткие сроки значительное количество качественного посадочного материала.

2) Освоен метод клонального микроразмножения растений in-vitro, методом микрочеренкования на примере сем. Паслёновых (Solanaceae).

3) 60% выбраковки по асептике. 50% выбраковки по жизнеспособности.

Список литературы:

1. Андронова Е.В. О биологическом разнообразии, семенном размножении in vitrо и репатриации орхидных // Вестник Тверского государственного университета, 2007. №7 (35). С. 8-11.

2. Антипина В.А. Размножение редких тропических орхидных in vitro // Матер. II Всерос. науч.-практ. конф. «Биология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», Белгород, 19–21 августа 2008. С. 29–33.

3. Батыгина Т. Б. Размножение растений / Батыгина Т. Б., Васильева В. Е. – СПб.: С.-Петерб. ун-т, 2002. – 232 с.

4. Буюн Л.И. Микроморфологические особенности листьев Guarianthe bowringiana (Bateman ex Lindl.) Dressler & W.E. Higgins (Orchidaceae Juss.) in vitro и in vivo // Труды VIII Международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти Ивана Григорьевича и Татьяны Ивановны Серебряковых/ под общ ред. д.б.н. В.П.Викторова. М.: МПГУ, 2009. Т.1. С. 88-90.

5. Варлыгина Т.И. Охрана орхидных (Orchidaceae) в России // Вест. Тв. ГУ, серия Биология и Экология. 2007. №7 (35). С.70-74.

6. Вахрамеева М.Г., Денисова Л.В., Никитина С.В., Самсонов С.К. Орхидеи нашей страны. М.: Наука, 1991. 223 с.

7. Вельмяйкин И.Н., Мокшин Е.В., Лукаткин А.С. Влияние регуляторов роста на размножение и рост побегов Cymbidium hybridum hort. In vitro. – Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, Биология, -2013, №3(1), с. 133-137.

8. Виноградова Т.Н. Два варианта развития ювенильных растений в естественной популяции Dactylorhiza maculata (L.) Soó (Orchidaceae). // Бюлл. МОИП. Отд. биол. 1999. Т.104, вып.4. С.40-45.

9. Висящева Л.В., Соколова Т.А. Промышленное цветоводство. М.: Агропромиздат, 1991. 386 с.

10. Воскресенская Н.П. Принципы фоторегулирования метаболизма растений и регуляторное действие красного и синего света // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений / Под ред. Курсанова А.Л. и др. - М.: Наука, 1975. - С. 16-36.

11. Герасимов С.О., Журавлев И.М. Орхидеи. - М.: Росагропромиздат, 1988. - 208 с. Карначук Р. А., Головацкая И.Ф. Гормональный статус, рост и формирование растений,выращенных на свету разного спектрального состава // Физиология растений. - 1998. - Т. 45, №6. - С. 925 - 934.

12. Головацкая И.Ф., Карначук РА. Свет и растение. - Томск: Изд-во Томского университета, 1999. - 100с.

13. Гродзинский A.M. Биология орхидей. Загадки и перспективы // Охрана и культивирование орхидей. Киев: Наукова думка, 1983. С. 3–6.

14. Захаревич С.Ф. К методике описания эпидермиса листа // Вестн. Ленингр. ун-та. 1954. № 4. С. 65-75.

15. Иванников, Р. В., Лаврентьева, А. Н. Семенное размножение Psichopsiella limminghei Lindl. (Orchida-ceae Juss.) в условиях асептической культуры [Текст] / Р. В. Иванников, А. Н. Лаврентьева // Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и ра-ционального использования растительных ресурсов. Материалы междунар. конф., посвящ. 60-летию ГБС РАН. – М., 2005. – С. 190–193.

16. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. – К.: Наук. думка, 1980.488 с.

17. Карначук РА. Регуляторное влияние зеленого света на рост и фотосинтез листьев //Физиология растений. - 1987. - Т. 34, № 4. - С. 765 - 773.

18. Катаева Н. В., Бутенко Р. О. Клональное миркоразмножение растений//Селекция. -1983.

19. Клональное микроразмножение растений: Учебно-методическое пособие / О.А. Тимофеева, Ю.Ю. Невмержицкая. – Казань: Казанский университет, 2012. – 56 с.

20. Козицкий Ю.Н., Борукаева М.Ф., Смирнова Н.С. Регуляторы роста и микроразмножение цветочных культур // Цветоводство. 1980. № 2. С. 13–15.

21. Красная Книга Российской Федерации (растения и грибы). М. Министерство природных ресурсов и экологии РФ и Росприроднадзора, 2008. С. 352 – 421, 786

22. Куликов П.В., Филиппов Е.Г. О методах размножения орхидных умеренной зоны в культуре in vitro // Бюл. ГБС. 1998. Вып. 176. С. 125-131.

23. Куликов П.В., Филиппов Е.Г. Прорастание семян и развитие проростков in vitro у некоторых орхидных умеренной зоны // Экология и интродукция растений на Урале. Екатеринбург, 1991. С. 39-43.

24. Куликов П.В., Филиппов Е.Г. Семенное и микроклональное размножение in vitro как метод сохранения генофонда орхидных умеренной зоны // Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1996. С. 137-139.

25. Кушнир, Г. П., Будак, В. Е. Опыт клонального микроразмножения орхидей [Текст] / Г. П. Кушнир, В. Е. Будак. – Киев : Изд-во ЦРБС АН УССР, 1983. – С. 84–86.

26. Охрана и культивирование орхидей. – Киев.- 1983.

27. Охрана и культивирование орхидей. Материалы IX Международной конференции (26 – 30 сентября 2011г.) - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2011, 500 с.

28. Поддубная-Арнольди В. А. Орхидеи и их культура / В. А. Поддубная-Арнольди, В. А. Селезнева. – М.: АН СССР, 1957. – 174 с.

29. Процесса прорастания семян cephalanthera damosonium(mill.) Druce (orchidaceae). - Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского.- Серия «Биология, химия». Том 22 (61). 2009. № 2. С. 3-8.

30. Р Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельско-хозяйственной науке и практике // В кн.: Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Наука, 1990. С. 154–235.

31. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов биотех-нологии. М.: МГУЛ, 2004. 84 с.

32. Селезнева В.А. Тропические и субтропические орхидеи.М.: Наука,1965. 170с.

33. Степанюк Г. Я., Хоцкова Л. В. Биологические особенности некоторых видов тропических орхидей, интродуцированных в Сибирском ботаническом саду ТГУ. Ярославский педагогический вестник – 2012 – № 4 – Том III (Естественные науки).

34. Степанюк, Г. Я. Размножение тропических и субтропических растений in vitro в Сибирском ботаническом саду [Текст] / Г. Я. Степанюк // Проблемы интродукции растений и отдаленной гибридизации. – М., 1998. – С. 196–197.

35. Степанюк, Г. Я. Размножение тропических и субтропических растений in vitro в Сибирском ботаническом саду [Текст] / Г. Я. Степанюк // Проблемы интродукции растений и отдаленной гибридизации. – М., 1998. – С. 196–197.

36. Фатеева Е. В., Мокшин Е. В., Лукаткин А. С. Влияние концентрации минеральной основы среды и регуляторов роста на органогенез цимбидиума гибридного в культуре in vitro. Труды Карельского научного центра РАН. № 3. 2013. С. 143–148.

37. Хоцкова Л.В., Степанюк Г.Я., Карначук Р.А. Роль селективного света в морфогенезе и содержании фотосинтетических пигментов проростков cymbidium hybridum на начальных этапах онтогенеза. 93 научные ведомости\\Серия Естественные Науки. 2011 . № 3 (98). Выпуск 14/1

38. Черевченко Т. М. Орхидеи в культуре / Т. М. Черевченко, Г. П. Кушнир. – К.: Наук. думка, 1986. – 200 с.

39. Черевченко Т.М. Тропические и субтропические орхидеи / Отв. ред. Д.Н. Доброчаева; НАН Ук-раины, Центр. бот. сад им. Н.Н. Гришко. Киев: Нау-кова думка, 1993. 254 с.

40. Черевченко, Т. М. Орхидеи в культуре [Текст] / Т. М. Черевченко, Г. П. Кушнир. – Киев : Наукова думка, 1986. – 200 с.

41. Шевцова Г. Г. Развитие репродуктивных структур Cymbidium hybridum Hort. и Dactylorhiza maculate L. (Soo) в культуре in vitro: автореф. Дисс…. на соискание учен. степени канд. биол. наук : спец. 03.00.05 «Ботаника» / Г. Г. Шевцова. – Кишинев, 1989. – 25 с.

42. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1971.

43. Шосер Г. Орхидеи. Выращивание в домашних условиях. Разведение и уход / Шосер Г. – М.: Интербук-бизнес, 1997. – 132 с.

44. Arditti J., Ghani A.K.A. Numerical and physical properties of orchid seeds and their biological implications // New Phytologist. 2000. Vol. 145. P. 367-421.

45. Averyanov L.V., Averyanova A.L. Update checklist of the orchids of Vietnam. Hanoi: Vietnam National University Publishing House, 2003. 102 p.

46. Chowdhury I., Rahman A.R.M., Islam M.O., Matsui S. Effect of plant growth regulators on callus proliferation, plantlet regeneration and growth of plant-lets of Doritaenopsis orchid // Biotechnology. 2003. V. 2. P. 214–221.

Интернет источники:

1. http://clubbrain.ru/referatu-botanika/rastenie-iz-probirki/

2. http://elementy.ru/lib/431454?page_design=print

3. http://forum.homecitrus.ru/topic/14207-falenopsis-phalaenopsis/

4. http://info.permecology.ru/redbook/008_haract.html

5. http://obiclub.ru/articles/garden/landscaping/3255

6. http://ufabotgarden.ru/?part_id=496,549

7. http://vinograd.info/knigi/sovremennye-dostizheniya-biotehnologii/biotehnologiya-kriosohraneniya-semyan-i-protokormov-orhidey.html

8. http://www.orchidee.ws/krankheiten/02.htm

9. http://www.orxidea.ru/biolog_stroen.php

10. http://www.sad.ru/?cat=orhidea_biologich_osob

11. http://www.sevin.ru/bioresrus/classification/secured_animals_pr.html

12. http://www.unn.ru/pages/issues/vestnik/99999999_West_2010_2(2)/10.pdf

13. http://www.vokrugsveta.ru/encyclopedia/index.php?title=%D0%9E%D1%80%D1%85%D0%B8%D0%B4%D0%B5%D0%B8

14. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%B5%D0%B3%D0%B5%D1%82%D0%B0%D1%82%D0%B8%D0%B2%D0%BD%D0%BE%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%BD%D0%BE%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5

15. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%BD%D0%BE%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B9

16. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A4%D0%B0%D0%BB%D0%B5%D0%BD%D0%BE%D0%BF%D1%81%D0%B8%D1%81