Методы цитологических исследований

Методы цитологических исследований

Маркова Н.В.

Что такое цитологическое исследование

Цитология (от греч. "цитос" - клетка, "логос" - учение, наука) – наука о строении, функциях, метаболизме, взаимоотношениях со средой, развитии и происхождении клеток.

Цитологическое исследование – метод диагностики, позволяющий выявить качественные и количественные изменения клеток, наличие внутри- и внеклеточных включений и микроорганизмов.

Оно основано на изучении особенностей строения клеток, клеточного состава органов, тканей, жидкостей организма человека в норме и при патологических процессах.

Современные методы цитологических исследований

• Световая микроскопия

2. Электронная микроскопия

3. Цитотохимические методы

4. Метод фракционирования клеток

5. Авторадиография

6. Культивирование клеток

7. Рентгеноструктурный анализ

8. Микрохирургия

1. Световая микроскопия

Исторически сложилось, что первым оптическим прибором был световой микроскоп. Лучший световой микроскоп имеет разрешающую способность около 200 нанометров, что примерно в 500 раз улучшает возможности человеческого глаза.

Виды световой микроскопии:

• Фазово-контрастная микроскопия.

• Поляризационная микроскопия.

• Интерференционная микроскопия.

• Микроскопия в темном поле.

• Ультрафиолетовая микроскопия.

• Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия.

1.1. Фазово-контрастная микроскопия

• Фазово-контрастная микроскопия основана на интерференции (перераспрелелении интенсивности) света: прозрачные объекты, отличающиеся по показателю преломления от окружающей среды, выглядят либо как темные на светлом фоне (позитивный контраст), либо как светлые на темном фоне (негативный контраст). Фазово-контрастная микроскопия применяется для изучения живых микроорганизмов и клеток в культуре ткани.

1.2. Поляризационная микроскопия

• Поляризационная микроскопия это метод наблюдения в поляризованном свете объектов, имеющих различие свойств среды (показатель преломления, теплопроводность и др.) Применяется в основном для изучения митоза.

Поляризованный свет – это излучение, волны которого колеблются в одной плоскости. Поляризация света – процесс устранения бликов и помех, возникающих при отражении и преломлении света.

1.3. Интерференционная микроскопия

1.3. Интерференционная микроскопия

Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод даёт возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета).

Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста — это возможность определять по цвету и яркости свойства микрообъектов.

1.4. Темнопольная микроскопия

• Темнопольная микроскопия основана на рассеянии света микроскопическими объектами. Объекты при темнопольной микроскопии выглядят ярко светящимися на темном фоне. Применяется темнопольная микроскопия преимущественно для изучения спирохет и обнаружения (но не изучения морфологии) крупных вирусов.

Спирохеты  -  тонкие , спирально завитые бактерии

1.5. Ультрафиолетовая микроскопия

• В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит способность некоторых веществ (ДНК, РНК) поглощать ультрафиолетовые лучи. Она дает возможность наблюдать и количественно устанавливать распределение этих веществ в клетке без специальных методов окраски. В ультрафиолетовых микроскопах используется кварцевая оптика, пропускающая ультрафиолетовые лучи.

1.6. Люминесцентная микроскопия

• В основе люминесцентной микроскопии лежит явление люминесценции, т. е. способности некоторых веществ светиться при облучении их коротковолновой (сине-фиолетовой) частью видимого света либо ультрафиолетовыми лучами с длиной волны, близкой к видимому свету. Люминесцентная микроскопия используется в диагностических целях для наблюдения живых или фиксированных микроорганизмов, окрашенных люминесцирующими красителями (флюорохромами) в очень больших разведениях.

Люминисцентные микроскопы Разрешение таких микроскопов соответствует световым.

Их особенность в том, что препарат освещается снизу не пучком видимого света, а ультрафиолетовым лучом определенной длины волны.

Другая особенность метода в том, что используются не обычные, а люминисцентные , или флюоресцентные красители для окрашивания препаратов. Такие красители под воздействием ультрафиолета дают яркое свечение .

Исследователь видит препарат на темном фоне, где ярко светятся окрашенные участки клеток.

Культура стромальных стволовых клеток человека. Зеленым флюоресцирует цитоплазма, содержащая нестин, синим — ядерный материал.

красным цветом флуоресцирует ДНК клеток, зеленым – клеточная стенка и цитоплазма с содержащимися в ней пластидами.

2. Электронная микроскопия

В начале 30-х годов XX века был создан электронный микроскоп, который давал биологам возможность увидеть объекты размером 0,5 нанометров. В нём используют пучок электронов вместо светового луча.

Электронная микроскопия

• Электронная микроскопия принципиально отличается от световой как устройством электронного микроскопа, так и его возможностями. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на экране и фотографируют. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз. С помощью электронного микроскопа изучают ультратонкое строение микроорганизмов и тканей, а также проводят иммунную электронную микроскопию.

Сканирующая микроскопия

Одним из видов электронного микроскопа является сканирующий микроскоп. В нём электронный луч отражается от исследуемого образца, благодаря чему можно получить трехмерное изображение объекта.

Пыльца под сканирующим электронным микроскопом

3. Цито- и гистохимические методы

Эти методы используют для исследования химического состава клетки и локализации в ней конкретных химических веществ. Они основаны на избирательном окрашивании разных компонентов клетки.

С помощью цитохимических цветных реакций в клетках выявляют полисахариды, специфические аминокислоты в белках, нуклеиновые кислоты, жиры, липиды и множество ферментов, участвующих в метаболических процессах обмена и превращения веществ.

4. Метод фракционирования клеток

С середины ХХ века цитологи получили возможность исследовать не только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в жизнеспособном состоянии.

Метод фракционирования клеток, основанный на дифференциальном центрифугировании.

Разделительное центрифугирование

Этот метод используется для выделения и изучения отдельных органоидов клетки. Разные компоненты клетки отличаются по массе и плотности, поэтому под действием центробежной силы они оседают на дно с разными скоростями, что позволяет изучать их детально.

Разные органоиды осаждаются на дно пробирки при разных скоростях центрифугирования.

Скорость оседания зависит от размера частицы и ее плотности.

При низких скоростях центрифугирования в первую очередь осаждаются ядра. Получив осадок ядер, оставшуюся суспензию переливают в другую пробирку для следующего этапа центрифугирования. Осадок, состоящий из клеточных ядер, размешивают и используют в экспериментальной работе. Так повторяют несколько раз, увеличивая скорость и продолжительность центрифугирования. Самые высокие скорости центрифугирования необходимы для получения самых маленьких органелл – рибосом.

Центрифуга

С помощью этого метода впервые в клетках были открыты лизосомы – небольшие вакуоли, содержащие гидролитические ферменты и выполняющие пищеварительные функции в клетках. После открытия лизосом методом фракционирования, их обнаружили на срезах клеток под световым и электронным микроскопом с помощью метода цитохимии, выявив работу специфических ферментов.

5. Авторадиография

Если требуется проследить за судьбой какого-либо химического соединения в клетке, то можно заменить один из атомов в его молекуле на радиоактивный изотоп. Тогда эта молекула будет иметь радиоактивную метку, по которой ее можно обнаружить с помощью счетчика радиоактивных частиц или по способности засвечивать фотопленку. Метод авторадиографии используют для выяснения, в каких местах в клетке идет синтез тех или иных полимерных молекул, для изучения, куда переносятся синтезированные вещества.

Авторадиограмма, показывающая распределение фосфора в листьях томата

6. Культивирование клеток

Метод клеточных культур заключается в выращивании клеток или целых организмов из отдельных клеток с помощью питательных веществ и в условиях полной стерильности. Этот метод дает нам возможность изучать клетки разных органов, тканей растений и животных, а также, деление клетки, их дифференциации и специализации.

Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и механическую обработку, и получают суспензию клеток.

Затем клетки помещают в специальные сосуды с плоским дном: стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной средой.

Для каждого типа клеток среда индивидуальна.

Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой процент сыворотки крови.

Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную температуру, не допускать инфекционного заражения. Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых клеток.

7. Рентгеноструктурный анализ

Данный метод даёт возможность определять пространственное строение и физические свойства молекул, входящих в состав клеточных структур. В основе данного метода лежит явление дифракции рентгеновских лучей на трёхмерной кристаллической решётке.

8. Микрохирургия

Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток, для выяснения функций отдельных органов. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление отдельных органелл.

Органеллы  - специализированные микроструктуры, которые постоянно присутствуют в  клетке  и выполняют ряд жизненно важных функций

Микрохирургия

Микрохирургия позволяет с помощью специальных микроманипуляторов выполнять различные операции на клетке и ее органоидах. С помощью микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекции) и т. д. Микроманипулятор совмещают с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которых и делается операция. Широко применяют микропучки УФ-света или лазерные микропучки.

• Клонирование шпорцевой лягушки

Вывод

Развитие цитологии шло одновременно с усовершенствованием техники и методов исследования.