Общие понятия о микроорганизмов.

1. Положение микроорганизмов в природе. Особенности строения эукариотической и прокариотической клетки. Химический состав клетки. Характеристика отдельных таксономических групп микроорганизмов.

Для третьего царства животных существ Геккело предложил в 1866 г. собирательное название - протисты.

Микроорганизмы легко приспосабливаются к условиям существования, высокая выносливость к теплу, холоду, недостатку влаги, способность к быстрому размножению. Активно участвуют в различных превращениях веществ в природе.

Многие микроорганизмы имеют и отрицательное значение. Они могут являться возбудителями болезней человека, животных и растений, вызывать порчу пищевых продуктов, нанося большой ущерб народному хозяйству.

По особенности строения клетки протисты делятся на 2 группы:

- Высшие протисты, клетки которых сходны с животными и растительными клетками - эукариоты (входят водоросли, грибы, простейшие)

- Низшие протисты - к ним относятся бактерии сине-зеленые водоросли - прокариоты.

Различия в строении клетки:

- прокариоты не имеют оформленного ядра- ядерные образования (неклеотид);

- различия в строении клеточной оболочки, так у водорослей основным компонентом клеточной стенки является – целлюлоза, у животных - хитин.

- у прокариот нет митохондрии по сравнению с эукариотами

По химическому составу все живое вещество практически сходны: важнейшим компонентом для всех организмов является ДНК ( дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) и белок.

Важнейшими химическими элементами, преобладающими в составе клеток м/организмов, является углерод, кислород, Н₂, N₂, S, Р, К, Мg, Са и Fе.

Первые из 4 элементов составляют основу органических веществ - их называют органогенными элементами. Их соединения 90-97% на сухое вещество. Другие элементы называются зольными или минеральными, на их долю приходится 3-10%. В составе микроорганизмов вода занимает 75-90% массы. Все вещества поступают в клетку только с водой и с ней же удаляются. Часто вода в клетке находится в связанном (с белками, углеводами).

В состав клеток микроорганизмов входят белки простые (протеины) и сложные (протеиды). Белки выполняют две основные функции: во-первых, входят в состав всех мембран клетки; во-вторых, играют роль ферментов-биохимических катлизаторов. Среди белков есть и такие, которые убивают жизнь,- токсины. Также в состав клеток микроорганизмов входят в небелковые азотистые вещества - аминокислоты, пурины и др.

Углеводы в теле микроорганизмов используются для синтеза белков и жиров, построения клеточных оболочек и капсул, а также в качестве энергетического материала в дыхательных процессах. Углеводы как и белки могут откладываться в клетках в виде запасных питательных веществ.

В теле микроорганизмов углеводы встречаются в виде пентоз, гексоз, полисахаридов. полисахариды находятся и в связанном состоянии с белками и минералами.

В клетках микроорганизмов жировые вещества находятся в свободном (как запасные вещества) и в связанном состоянии, в комплексе с белками и углеводами. Больше всего липидов сосредоточено в цитоплазматической мембране клеток.

В микроорганизмах имеются также кислоты и их соли, спирты, пигменты, витамины.

Помимо истинных бактерии имеются и другие более или менее отличающиеся от них. Это актиномицеты, нитчатые бактерии, спирохеты, риккетсии, микоплазмы, миксобактерии.

2. Физиология микроорганизмов: основные пути поступления питательных веществ в клетку; рост микроорганизмов и культивирование; типы питания и дыхания микроорганизмов.

Поступление веществ в клетку и выделение продуктов обмена в окружающую среду происходит у микроорганизмов через всю поверхность тела путем осмоса или адсорбции. На интенсивность этих процессов оказывают различные факторы: разность концентрации питательных веществ в клетке и за ее пределами, а также проницаемость для них оболочки.

Цитоплазматическая мембрана клетки обладает полупроницаемостью: она является осмотическим барьером, регулируя поступление в клетку и выход из нее растворенных веществ. Вещества не растворимые в воде, белки, не могут быть использованы клеткой. Они могут проникнуть в нее лишь после расщепления на более простые, что происходит с помощью экзоферментов микробов.

Второй путь поступления веществ в клетку осуществляется путем переноса их особыми, локализованными в цитоплазматической мембране веществами ферментной природы.

Углеродное питание.

По источнику углеродного питания микроорганизмы разделяются на две группы:

Автотрофные: способны в качестве единственного источника углерода для синтеза органических веществ тела использовать углекислоту и ее соли.

Одни виды автотрофных микроорганизмов ассимилируют СО₂, используя солнечную энергию - фотосинтезирующие микроорганизмы.

Другие микроорганизмы используют энергию химических реакций окисления некоторых минеральных веществ - хемосинтезирующие.К фотосинтезирующим микроорганизмам относятся водоросли, пигментные бактерии.

Гетеротрофные микроорганизмы в качестве источника углерода используют органические соединения. К ним относятся бактерии, грибы, дрожжи.

Азотное питание

В зависимости от того, какими источниками азота микроорганизмы пользуются их подразделяют на 2 группы:

1. Аминоавтотрофные микроорганизмы, синтезирующие белковые вещества за счет минеральных источников азота или простейших форм органического азота типа мочевины.

2. Аминогетеротрофные микроорганизмы способные синтезировать ряд аминокислот из простейших источников азота, но неспособные самостоятельно синтезировать какую-нибудь одну аминокислоту.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы. Обли­гатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Обли­гатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столб­няка, бактероиды) растут на среде без кислорода, который для них токсичен. Факультативные анаэробы могут расти как при на­личии кислорода, так и без него, поскольку они способны пере­ключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение, если кислород отсутствует.

3 Рост микроорганизмов. Влияние внешних факторов на рост микроорганизмов. Методы обнаружения и выделения микроорганизмов.

Рост микробной клетки – это увеличение размера и массы одной особи между двумя делениями. Конечная цель развития м/организма - размножение. Для роста

м/организмов необходимые условия: в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, и в такой форме, которую микроорганизм способен усваивать; наличие воды; определенная температура, реакция среды рН; осмотическое давление.

4 фазы роста: Начальная фаза (лаг фаза) охватывает промежуток времени между началом роста и достижением максимальной скорости роста; Экспоненциальная фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться и фаза отмирания.

Культивировать (выращивать) м/организмы можно двумя способами: поверхностное культивирование (на твердые питательные среды- аэробы)и глубинное культивирование ( на жидких питательных пит.средах по всей глубине- анеэробы).

Факторы внешней среды:

1. Физические факторы: влажность, концентрация растворенных веществ, температура, лучистая энергая.

2. Химические: реакция среды рН, ядовитые вещества.

3. Биологические: антибиотики, фитонциды.

Чтобы опрнеделить общее количество м/организмов в различных субстратах, выявить и учесть численность представителей отдельных групп и видов м/организмов применяют методы:

1) прямой подсчет клеток под микроскопом(в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках)

2) выделение и учет высевом на плотные среды

3) выделение и учет высевом на жидкие среды.

4. Важнейшие биохимические процессы, вызываемые микроорганизмами. Превращение безазотистых органических веществ: аэробные и анаэробные процессы брожения. Превращение азотсодержащих веществ.

В процессе обмена веществ м/организмамы осуществляют разнообразные химические реакции, в результате которых образуются ценные вещества: спирты, кислоты, эфиры и др.Эти продукты жизнедеятельности широко используются в промышленности. К анаэробным процесам брожения относится спиртовое брожение.

Спиртовым брожением называется процесс расщепления сахара микроорганизмами с образованием этилового спирта и углекислого газа.

С₆Н₁₂О₆ - 2СН₃СН₂ОН+2СО₂

Возбудителями спиртового брожения являются дрожи сахаромицеты, некоторые мицеальные грибы. Процесс проходит 2 стадии

1. Окислительная - превращение глюкозы до пировиноградной кислоты (пируват) и отнятие двух пар водорода.

С₆Н₁₂О₆--2СН₃СОСООН= “НАД (кофермент) Н₂О

2. Восстановительная –пировиноградная кислота при участии кофермента Над воостанавливается в

Характерной физиологической особенностью большинства дрожжей является их способность переключать обмен с одного типа (анаэробный) на другой (аэробный). Наряду с главными продуктами брожения в небольшом количестве образуются и побочные продукты: глицерин, уксусный альдегид, сивушные масла. Наибольшая скорость брожения при температуре 30 С. Нормальное брожение протекает в кислой среде, при рН 4-5.

К анаэробным процессам брожения можно отнести: молочнокислое брожение, пропионовокислое, маслянокислое и др.

К окислительным (аэробным) относятся вызываемые микро­организмами биохимические процессы, протекающие с участием кислорода воздуха.

Большинство аэробных микроорганизмов окисляют органи­ческие вещества в процессе дыхания до С0₂ и Н₂О. Однако некоторые окисляют их лишь частично. Конечными продуктами такого неполного окисления чаще являются кислоты.

Уксуснокислое брожение — это окисление бактериями эти­лового спирта в уксусную кислоту:

СН₃СН₂ОН + О₂'=СН₃СООН + Н₂О.

При уксуснокислом бро­жении реакция окисления этилового спирта протекает в две стадии: сначала образуется уксусный альдегид, который затем окисляется в уксусную кислоту:

2СН₈СН₂ОН + О₂ - 2СН₃СНО + 2Н₂О; 2СН₈СНО + 0₂ -* 2СН₈СООН.

Возбудителем уксуснокислого брожения является уксусный гриб

Уксуснокислые бак­терии представляют собой грамотрицательные, палочковидные, бесспоровые, строго аэробные организмы. Среди них есть под­вижные и неподвижные бактерии. Оyи кислотоустойчивы, и не­которые могут развиваться при рН среды до 3,2.

К аэробным процессам брожения можно отнести лимонокислое брожение, разложеие жиров и жирных кислот и др.

В метаболизме м/организмов азотсодержащие вещества подвергаются разнообразным превращениям. Способность разрушать белковые вещества способны многие м/организмы. Этот процесс также называют процессом гниения. Некоторые м/организмы разлагают непосредственно белки, другие могут могут воздействовать на более простые продукты распада, например на аминокислоты. и. Процесс распада начинается с гидролиза. Превичными прродуктами гидролиза являются пептицы и пептоны. Они расщепляются до аминокислот, котрые являются конечными продуктами. Образующеся в процессе распада белков различные аминокислоты используются самими м/организмами или подвергаются ими дальнейшим изменениям.

5. Объекты и методы биотехнологии. Основные стадии биотехнологического процесса:. предферментация, ферментация, постферментация. Подразделение биотехнологических процессов. Обезвреживание и утилизация отходов биотехнологических производств.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, клетки растений, животных и человека, биогенные вещества. Диапазоны распространяются от вирусов до человека. Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистка, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул.

Биотехнологические процессы подразделяются на биологические, биохимические, биоаналогичные. К первым относят те из них, которые основываются на использовании акариот, прокариот, вторые - на использовании ферментов, третьи - на химическом синтезе.

Некотрые биотехнологические процессы имеют свои специфические особенности ( культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах). С учетом этого все биотехнологические процессы делятся на микробиологические, фито- зообиотехнология.

По условиям проведения процесса различают нестерильные (крупнотонажное производство кормовых дрожжей) и стерильные (получение антибиотиков, витаминов): аэробные и анаэробные.

Процессы проводят в одном из 3 режимов:

• периодическое

• полунепрерывное;

• непрерывное.

Оновные стадии: предферментация, ферментация, постферментация

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты) начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН₄), метанол (СНзОН) и кончая природными био­полимерами.

Питательные среды готовят в Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, сред­ствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройст­вами. Питательные среды могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.

Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта., который можето сохранить на протя­жении длительного времени полезные свойства .На предприятие в условиях собственной центрально-заводской лаборатории обновляет культуру пу­тем периодических пересевов на специально подготовленной среде и в дальнейшем организует ее хранение в холодильнике при температуре 3-4°С. Проходит микробиологический контроль прежде всего проверяют чистоту культуры

Процесс ферментации может осуществляться 2-мя способами: поверхностного культивирования, когда выращивание производствен­ной культуры производят на среде, содержащей твердые частицы субстра­та; 2) глубинного культивирования, когда выращивание той же культуры микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат.

Ферментационные процессы отличаются значениями контролируе­мых параметров. К ним, прежде всего, относятся температура, рН среды, объемный расход воздуха. При культивировании различных микробных клеток интервал рабочих температур варьирует от 25 до 60°С, значения рН - от 2 до 9, расход воздуха в аэробных процессах - от 0.15 до 2.5 м° на 1 м' среды в минуту. Продолжительность проведения отдельных фермента­ции сильно варьирует. Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивиро­вания в периодическом процессе не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет уже 48-72 ч, а вто­ричных - более 72-144 ч.

В зависимости от отношения организма-продуцента к кислороду различают аэробные и анаэробные процессы.

По окончании ферментации культуральная жидкость поступает на пе­реработку, где происходит выделение и очистка целевого продукта.

Выделить целевой продукт можно методм: фильтрования, сепарирования или концентрирования на бактофугах, использование барабанных вакуум-фильтров, методом осаждения, методом ультрафильтрации.

Последней стадией технологического цикла в микробиологическом синтезе является получение товарной формы продукта.

Отходы биотехнологических производств относятся к типу разлагающихся в природных условиях

Отходы биотехнологических производств подразделяются на твердые и жидкие и газообрзные..

Твердые отходы либо ожигают (перептобельно) либо передают на биологическое обезвреживание. Если отходом является биомасса клеток например стрептомицетов, их достаточно убить нагревом, далее их можно уже использовать в качестве добавок к кормам, в качестве удобрений. В аэробных очистных сооружениях, где происходит обезвреживание отходов, лимитирующими факторами выступают качество и площадь биопленки, состоящий из микро-макрофлоры и фауны.

Жидкие отходы мгут подвергаються микробиологической обработке.

"Отработанный воздух" биотехнологических процессов не должен поступать в атмосферу без очистки и обезвреживания, должен быть термически обработан и только после этого подвергаегся фильтрационной очистке.

6. Принципы технического обеспечения биотехнологических процессов. Различные типы биореакторов: аэробные и анаэробные. Тепловые процессы в ферментаторах. Особенности культивирования биообъектов.

Биотехнологические методы культивирования биообъектов выполняются в специальных оборудованиях-ферментаторах (биореакторах).

Биотехнологические процессы отличаются от химических процессов: во-первых, главными компонентами являются какой-либо биообъект (вирус, бактерии, грибы). Такие объекты отсутствуют в хим. технологии. Высокие температуры неприемлемы в биотехнологии, давление. Особенности биообъектов обуславливают принципы технического оснащения биопроизводств.:

- универсальность биореакторов, основан на использовании разных биобъектов;

- инертность материаллов, в процессе культивирования не будет происходить взаимодействие биобъектов с с металлическими конструкциями;

- эксплутационная надежность, оптимальные условия для протекания процесса;

- доступность, легкость обслуживания и т.д.

Для выращивания микроорганизмов были предложены типы биореакторов: конструкции у них в основном были сходны. Их можно подразделить на 2 типа: без подводки стерильного воздуха (для анаэробов) и с подводкой его (для аэробов).

Аэрируемые биореакторы могут быть с мешалками и без них. При конструировании биореакторов учитывается время протекания различных биологических процессов у представителей различных групп организмов.

Размеры ферментаторов определяются соотношением внешнего диаметра к высоте и составляет 1:2 до 1:6. Универсальными являются ферментаторы для анаэробных и аэробных процессов. Эти ферментаторы классифицируют по способу ввода в аппарат энергии для перемешивания:

• газовой фазой (ФГ)

• жидкой фазой (ФЖ)

• газовой и жидкой фазами (ФЖГ)

Примером аппарата группы газовой фазой может быть ферментатор с эрлифтом

В аппарате отсутствует механическое перемешивание, здесь проще поддерживать асептические условия. Воздух для аэрации подается по трубе который расположен вертикально в ферментаторе. Аэратор, который обеспечивает движение выходящего воздуха, расположен в нижней части диффузора и насыщает питательную среду воздухом. Газожидкостная смесь поднимается по диффузору и перемешивается через верхние края. Часть воздуха уходит из аппарата, а более плотная среда опускается вниз в кольцевом пространстве между корпусами ферментатора и диффузором.Так происходит многократная циркуляция среды в ферментаторе. Для отвода биологического тепла внутри ферментатора установлен змеевик, аппарат также снабжен секционной рубашкой. В производстве кормового белка широкое распространение получили ферментаторы с самовосстанавливающими мешалками из группы ФЖ -жидкой фазой. Ферментатор представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат, снабженный циркуляционными, теплообменными и аэрирующими устройствами. Теплообменные устройства выполняют в виде трубок, которые установлены в трубных решетках.

Ферментаторы периодического действия из групп (ФЖГ) - газовой и жидкой фазы применяются для получения антибиотиков, витаминов. Конструкция этого ферментатора обеспечивает стерильность ферментации длительное время. Важным элементом в ферментаторах являются теплообменные устройства. Применение концентрированных питательных сред, высокий удельный расход мощности на перемешивание - все это сказывается на возрастании тепловыделений и для отвода тепла в ферментаторе устанавливают наружные и внутренние теплообменные устройства. Промышленные ферментаторы имеют секционные рубашки снаружи, а внутри аппарата - четыре змеевика.

Общая продуктивность процесса в биореакторе определяется количеством целевого продукта в ЕД активности или в кг, получаемого с 1м³ ферментационной емкости в час. Расчет ведут отдельно - для периодического и непрерывного процесса. Общую продуктивность для непрерывных процессов определяют в установившемся режиме, а для периодических

процессов и полунепрерывных - с учетом времени на подготовку ферментатора к работе.

Объемная продуктивность процесса - это количество целевого продукта в ЕД активности или в кг, получаемое с 1м³ питательной среды в час.

Выход продукта от субстрата - это количество целевого продукта в ЕД активности или в кг, полученное из 1 кг компонента ферментационной среды, являющегося энергоносителем.

7. Химическая природа ферментов. Микробные ферменты, имеющие промышленное значение. Общие принципы получения ферментных препаратов.

Ферменты или эензимы – самый высокоспециализированный класс белковых молекул. Ферменты синтезируются самой клеткой и выполняют функции катализаторов биохимических реакций.

Ферментативный катализ протекает в живой клетке в ограниченном диапазоне температур, значений РН и давления. Одна из особенностей ферментов как катализаторов – строгая специфичность их действия. Когда фермент реагирует только с одним веществом – абсолютная специфичность, с группой веществ, обладающих общим структурными признаками – групповая специфичность.

Каталитическая активность ферментов чрезвычайно высока. Так, в живой клетке под воздействием фермента каталазы, которым служит железо, реакция протекает в 1010 раз быстрее, чем с неорганическим катализатором.

Все ферменты подразделяют на две группы:

ферменты-протеины, представляющие собой кристаллические белки (однокомпонентные);

ферменты-протеиды, имеющие в своем составе сложные белки.

Ферменты , будучи биокатализаторами приобрели важное практическое значение. Первый патент на грибную амилазу был получен еще а 1894 г. К настоящему времени описано выше 3000 ферментов.

В производственных условиях ферменты обычно получают в периодическом режиме культивирования продуцентов. Основная ферментация продолжается от одних до семи суток. Перед завешением ферментации культуральную жидкость быстро охлаждают +5, доводят рН до требуемого показателя, добавлют флокулянт пр последующих центрифугировании и вакуум-упаривании. Далее к упаренному центрифугата добавляют раствор электролита, затем фильтруют на вакуум- барабанном фильтре, фильтрат поступает в рефрижератор, из котрого его подвергают ультрафильтрации, консервируют, пропуская через мембранный фильтр, откуда он поступает на фасовку.

8 . Иммобилизованные ферменты- основа инженерной энзимиологии. Основные способы иммобилизации ферментов.

Важнейшм направлением в реализации каталитической функции ферментов является их иммобилизация, что обеспечивает многократное использование фермента в биотехнологических целях. Иммобилизация фермента- это любое ограничение свободы движения белковых молекул.

Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема: -адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля; включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем, при этом обеспечивается высокая прочность с носителем и не происходит загрязнения целевого продукта .

9. Общая характеристика генетической инженерии: генная, геномная и хромасомная. Этапы рДНК- биотехнологии. Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии. Проблемы безопасности в биоинженерии.

Генетическая инженерия - это методы получения рекомбинатных ДНК, объединяющих последовательности равного происхождения, т.е. осуществляется перенос целых хромосом от клеток-доноров в клетки-реципиенты - (получить рекомбинатную ДНК).

Технология рекомбинантных ДНК позволяет включать гены высших организмов в геном бактерий. В результате бактерии приобретают способность синтезировать «чужеродные» (рекомбинантные) продукты – соединения, которые прежде могли синтезировать только высшие организмы. На этой основе было создано множество новых биотехнологических процессов для производства человеческих или животных белков, ранее недоступных или применявшихся с большим риском для здоровья (пример гормон роста, человеческий инсулин).

Методами генетической инженерии добиваются клонирования генов. Это когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК .

Генетическую инженерию подразделяют:

- генную инженерию

- геномную инженерию

- хромосомную инженерию.

Сущность первой состоит в целенаправленном использовании перестроек естественного генома, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток. В качестве примера можно привести перемещение в вирусные геномы некоторых клеточных генов, придающих вирусам свойства онкогенности.

Сущность генной инженерии заключается в целенаправленной глубокой перестройке генома прокариот вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии вносят большое количество дополнительной генетической информации и получают гибридный организм, который отличается- от исходного по многим признакам. Здесь возможно получение половых (слияние гамет) или соматических (слияния неполовых клеток).

Получены рекомбинатные штаммы бактерий, дрожжей, вирусов, способные продуцировать разнообразные ферменты, гормоны, иммуномодуляторы. Расшифрофка генома человека позволит решить проблему многих заболеваний.

Хромосомная инженерия - сеть генетической инженерии, объектами ее является хромосомы клеток высших и низших микроорганизмов (прокариоты, эукариоты), благодаря хромосомной инженерии стало возможным лечение наследственных заболеваний, селекция пород животных, различных видов растений.

Практическое использование рекомбинатных ДНК различного происхождения составляет р ДНК - биотехнологии.

р ДНК - биотехнологию подразделяют на следующие этапы:

- получение чужеродной ДНК

- разрезание полученной ДНК на фрагменты и их очистка

- включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду

- клонирование генов

- амплификация и экспрессия р ДНК.

Исскуственное вмешательство в генетические структуры, их модификация с целью получения совершенных биообъектов, вызывает структурную перестройку в организме, что точно и своевременно нельзя спрогнозировать.Это вызывает беспокойство. Это сейчас актуально когда на рынок поступаю модефицированно измененные продукты питания.

10. Технологические основы получения важнейших продуктов биотехнологии.

В 20 в. промышленность использовала все разнообразие замечательных биосинтетических способностей микроорганизмов, и теперь ферментация занимает центральное место в биотехнологии.

Рассмторим на примере получения аминокислот.

Общая формула амнокислоты:

По значению для м/организма аминокислоты подразделяют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом и животном организме. Для человека- 8 аминокислот: изолейцин, лейцин, лизин, метиония, треонин, триптофан, валин, фенилаланин. М/организмы сами синтезируют аминокислоты из аммиака и нитратов. Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза.

Потребность в аминокислотах велика. В мире производится 500 тыс.тонн в год аминокислот. Широко используются в пищевой промышленности как питательные добавки. В больших количествах аминокислоты применяют как добавку к растительным кормам. Также применяют в медицине-4%, косметике. По объему .и по значимости первое место занимает- метионин.

Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов. Размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем на жидкой среде в колбах, посевных аппаратах, затем в головных ферментаторах.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии:

• ферментацию

• стабилизацию

Известны 2 способа получения аминокислоты:

• одноступенчатый

• двухступенчатый

По первому слособу-продуцент аминокислоты культивирует на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют.

В двухступенчатом способе микроб-продуцент культивирует в среде, где он получает и синтезирует все необходимые вещества для последующего синтеза целевого продукта.

11. Физико-химическая, микробиологическая характеристика активного ила. Закономерности биохимического окисления органических веществ в аэробных условиях.

Применение биологических методов для очистки сточных вод основано на способности различных групп м/организмов использовать компоненты этих вод в качестве эффективных источников энергии и материала для построения своего тела. Аэробные методы применяют в основном для малоконцентрированных субстротов (концентрация по БПК до 1000 мг/л).

Реализуется в аэротенках. Биоциноз аэротенков носит название активного ила.

Активный ил поддерживается во взвешенном состоянии с помощью воздуха. Для м/организмов активного ила воздух служит источниками кислорода и поддерживает хлопья ила во взвешенном состоянии. Активный ил и сточная вода поступают с одной стороны аэротенка и выводятся с другого торца.

Вторая модификация процесса биологической очистки воды осуществляется в биофильтрах. Важнейшая составная часть биофильтров - загрузочный материал, в качестве которого используют шлак, гравий, керамзит, пластмассовые материалы. Активная биомасса, называемая биопленкой, образует слизистый слой, обвалакивающий отдельные элементы загрузки.

По внешнему виду активный ил представляет собой хлопьевидную массу от светло-серого до темно-коричневого цвета. Хлопья ила густо заселены бактериями, которые заключены в слизистую массу Механизм хлопьеобразования связан с процессом развития колоний бактерий Образовывать хлопья способны многие роды бактерий.

Бионаселение активного ила и биопленки представлен м/организмами разных систематических групп-бактерий, простейшие, грибы,водоросли, многоклеточные животные, черви, личинки и др. Количество бактерий в активном иле составляет от 10⁸ до 10¹⁴ на 1 г сухого вещества. К числу самых распространенных бактерий относятся псевдомонады(50-88%) всего бактериального населения. В активном иле присутствуют аммонифицирующие, целлюлозоразрушающие, жирорасщепляющие, нитрифицирующие бактерии.

Практически всегда присутствуют актиномицеты, обнаруживаются грибы и дрожжи. Из животного населения- простейшие, которые представлены 2 типами-инфузориями и саргомастигофарами. Функции простейших: питаясь бактериями, они регулируют численность их, выполняют санитарную функцию, поедая сапрофитные и патогенные м/организмы, они осветляют воду

В аэротенках встречаются более 100 видов микрофауны.

Видовой состав бак.населения активного ила и биопленки идентичны. Однако количественные соотношения видов отличаются. Основная часть бактерий сосредоточена в биолленке в верхнем слое глубиной до 0,5 м.

Здесь интенсивно размножаются грибы, нитчатые бактерии, жгугиковые. Небактериальное население активного ила и биопленки различаются. Если в активном иле черви присутствуют в небольшие количествах, то в биофильтре они постоянные обитатели. Черви в качестве источника питания потребляют биопленку.

12. Микробиологическая характеристика анаэробного ила.

Анаэробная очистка сточных вод проводится в метатенках..Анаэробным илом называют биоценоз м/организмов сбраживающих осадки.

Процесс биохимического окисления веществ в анаэробных условиях. Проходит в 2 стадии

1. стадия кислого брожения.

Ее осуществляют кислотообразующие бактерии. Благодаря им все органические компоненты осадков подвергаются деструкции. Анаэробный ил обладает гидролитической активностью. В нем обнаружены гидролитические ферменты: протеазы, глюкозидазы, липазы. Под действием этих ферментов исходные вещества осадка и активного ила, подвергаясь внеклеточному гидролизу, превращаются в соединения, которые доступны клеткам бактерии.

Кислотообразующие бактерии превращают белковые соединения, жиры и углеводы осадков сточных вод в низшие жирные кислоты, спирты, аммиак, водород и сероводород.

Кислотообразующие бактерии представлены облигатными и факультативными анаэробами. Выделено из бродящего осадка от 50 до 92 видов, половину из них составляют спорообразующие формы. Они различны по физиологическим особенностям. Степень развития отдельных физиологических групп зависит от состава обрабатываемых осадков.

2. стадия щелочного брожения.

Осуществляется метанообразующими бактериями строгими анаэробами

Этот процесс проходит двумя путями, котрые осуществляют две разные группы метаногенов.

Первый путь по которому образуется 72% метана,-расчепление ацетата

СН₃СООН -—— СН₄ + С0₂ (1)

Второй путь, по которому образуется 28% метана,-восстановление диоксида углерода. Образования метана характерен для тех видов метаногенных бактерий, которые не способны утилизировать уксусную кислоту и метанол. Это бактерии синтезируют метан в результате восстановления диоксида углерода по реакции:

СО₂ +4Н₂ ---- 4СН ₄ + Н₂О (2)

В процесс метанообразования вовлекаются и более сложные вещества, такие как масляная, пропионовая, капроновая кислоты. Превращение их осуществляется по типу реакции, в которой вместо молекулярного водорода участвуют перечисленные органические субстраты. Например, при использовании этилового спирта он окисляется до СНзСООН с одновременным восстановлением диоксида углерода по типу реакции:

2СН₃СН₂ОН+ СО₂ -- СН₄ + 2СН₃СООН

Некоторые виды метаногенных бактерий восстанавливают СО₂,потребляя молекулярный водород:

Почти все метаногенные бактерии принадлежат к мезофилам. Оптимальная температура составляет 35-40С. Половина метанообразующих бактерий в качестве источника углерода используют углекислый газ. Сложные органические соединения метагенные бактерии потреблять не могут. Источником азота для метанобразующих бактерий служат аммонийные соединения.

13. Микробиология воздуха, воды и почвы. Санитарно-микробиологическая оценка питьевой воды, поверхностных водоемов, почвы и атмосферного воздуха.

МИКРОФЛОРА ВОЗДУХА

В атмосферный воздух микроорганизмы попадают с поверх­ности земли и предметов вместе с подымающейся пылью, а также с мельчайшими капельками влаги, сдуваемыми с вод­ной поверхности. Микроорганизмы находятся в воздухе обычно вместе с частицами пыли.

Воздух не является благоприятной средой для развития микроорганизмов, так как в нем отсутствует капельно-жидкая вода. В воздухе микроорганизмы лишь временно могут сохра­нять жизнеспособность, и многие из них более или менее быстро погибают под влиянием высушивания и солнечных лучей.

Количественный и качественный состав микрофлоры атмо­сферного воздуха может существенно изменяться в зависимости от климатических условий, времени года и других факторов. Над морями, горами, ледяными полями Арктики воздух содер­жит очень мало микробов. Значительно больше их в воздухе населенных местностей, особенно крупных промышленных го­родов. Чем больше в воздухе пыли, тем больше в нем микро­организмов. Каждая пылинка может нести на себе множество микробов.

Большое значение для уменьшения количества микробов в воздухе имеют зеленые насаждения. Листья деревьев и кус­тарников обладают значительной пылезадерживающей способ­ностью.

Состав микрофлоры воздуха нестабилен. В воздухе нахо­дятся обычно наиболее устойчивые против высыхания и дей­ствия ультрафиолетовых лучей различные микрококки, сарцины, споры бактерий и грибов, дрожжи. Могут встречаться и болезнетворные микроорганизмы, особенно устойчивые к вы­сушиванию, например туберкулезные палочки, патогенные стрептококки и стафилококки, вирусы. Человек в среднем за сутки вдыхает 12000 л воздуха. При этом в дыхательных путях задерживаются 99,8% микроорганизмов, содержащихся в воздухе.

На микрофлору воздуха следует обращать большое внимание, так как воздух служит источником инфицирования микробами пищевых продуктов. Через воздух могут передаваться и некоторые инфекционные заболевания, возбудители которых выделяются больными и ба­циллоносителями при разговоре, чихании, кашле.

Санитарная оценка воздуха. Для определения микрофлоры воз­духа используют следующие методы: - седиментационный (метод Коха), фильтрационный (воздух пропускают через воду); методы, основанные на принципе ударного действия воздушной струи с использованием специальных приборов. Последние методы надежнее, так как они позволяют

точно определить коли­чественное загрязнение воздуха микроорганизмами и изучить их видовой состав.

На предприятиях пищевой промышленности, в производствен­ных цехах и в местах хранения продуктов необходимо соблюдать как определенную влажность и температуру, так и чистоту воз­духа.

В молочной промышленности санитарное состояние воздуха производственных помещений оценивают по двум микробио­логическим показателям: общему числу бактерий (микрококки, сарцины, палочковидные) и числу плесневых грибов и дрожжей, которые оседают из воздуха на поверхность агаровой среды (мясо-пептонного и суслового агаров) в чашках Петри за 5 мин.

На предприятиях мясной промышленности в холодильных ка­мерах проводят анализ воздуха на присутствие плесневых грибов.

Воздух камер исследуют перед закладкой мяса (до и после де­зинфекции) и периодически -- не реже 1 раза в квартал в про­цессе хранения мяса при температуре -12 °С. Учет ведут по числу колоний плесневых грибов, выросших на поверхности агаровой среды на чашках Петри.

Санитарную оценку воздуха закрытых помещений осуществляют по двум микробиологическим показателям: общему количеству микроорганизмов и количеству санитарно-показательных стрептококков в 1 м³ воздуха

По числу клеток в 1 м³ воздуха судят о степени обсеменения стрептококком носоглоточной микрофлоры человека и животных а следовательно, о возможном наличии в воздухе патогенных микроорганизмов.

Своевременная окраска, побелка стен и потолков, ежеднев­ная влажная уборка помещений, систематическая вентиляция, особенно с фильтрацией поступающего воздуха, значительно уменьшают запыленность помещений и количество в них мик­робов.

МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ

Почва является средой обитания микроорганизмов. Они на­ходят в почве все условия, необходимые для своего развития: пищу, влагу и защиту от губительного влияния прямых солнеч­ных лучей и высушивания.

Количественный и качественный состав микрофлоры различ­ных почв значительно колеблется .в зависимости от химического состава почвы, ее физических свойств, реакции, влагоемкости, степени аэрации. Существенно влияют также климатические условия, время года, способы сельскохозяйственной обработки почвы, характер растительного покрова и многие другие фак­торы.

Неодинаково распространены микроорганизмы и по гори­зонтам почвы. Меньше всего их содержится обычно в самом поверхностном, толщиной в несколько миллиметров, слое, где микроорганизмы подвергаются неблагоприятному воздействию солнечного света и высушивания.

Особенно обильно населен следующий слой почвы, толщи­ной до 5 см.. По мере углубления число микроорганизмов па­дает. На глубине 25 см, количество их в 10—20 раз меньше, чем в поверхностном слое толщиной 1—2 см, (по данным А. С. Разумова). Меняется с глубиной

и состав микрофлоры. В верхних слоях почвы, содержащих много остатков животных и растений, а также подвергающихся хорошей аэрации, преоб­ладают аэробные сапрофитные организмы, способные расщеп­лять сложные органические соединения. Чем глубже почвенные слои, тем беднее они органическими веществами; доступ воз­духа в них затруднен, поэтому здесь преобладают анаэробные бактерии.

В почве одновременно с минерализацией органических ве­ществ происходят процессы бактериального самоочищения — отмирание несвойственных почве сапрофитных и патогенных бактерий.

МИКРОФЛОРА ВОДЫ

Природные воды представляют собой среду, в которой мик­роорганизмы могут размножаться. Интенсивность размножения микробов в воде зависит от ряда факторов и в первую очередь от наличия в ней пищи. Природные воды всегда содержат в большем или меньшем количестве растворенные органические и минеральные вещества, которые могут быть использованы микроорганизмами в процессе питания. Количественный и ка­чественный состав микрофлоры различных природных вод раз­нообразен.

Возбудители кишечных инфекций и другие патогенные бак­терии в воде длительно сохраняются вирулентными. Так, воз­будитель брюшного тифа сохраняется в водопроводной воде 2— 93 дня, дизентерии—15—27, а холеры — 4—28 дней. В речной воде возбудители этих заболеваний сохраняют жизнеспособ­ность в течение соответственно 4—183 дней, 12—90 и 1 — 90 дней. Во льду также в течение нескольких недель остаются жизнеспособными бактерии коли-тифозной группы.

14. Обезвреживание и утилизация отходов биотехнологических производств. Проблемы безопасности в биотехнологии.

Отходами биотехнологического производства могут быть клетки (ткани) и культуральные жидкости после извлечения из них нужных метаболитов. Нет полной информации о количестве отходов всех биопроизводств в мире. Например, на одну тонну лимонной кислоты образуется 150-200 кг сухого мицелия.

Отходы биотехнологических производств относятся к типу разлагающихся в природных условиях под действием различных факторов (биологических-минерализация с участием м/организмов, химических-окисление, физико-химических-благодаря комплексному воздействию, например, лучистой энергии, химических веществ).

Отходы биотехнологических производств подразделяются на твердые и жидкие.

Плотные отходы в биотехнологических производствах представляют собой - микробную массу, отделяемую от культурольного фильтра:

- шламы;

- растительную биомассу, после экстракции из нее действующих веществ;

- некоторые тканевые культуры млекопитающих;

- осадки сточных вод (ил)

Подсчитано, что в коммунальных очистных сооружениях сточные воды от одного горожанина образуют за год около 500 литров ила.

В пивоварении плотными отходами являются дрожжевые клетки (0,40 кг на 1 гл пива), солодовая и хмельная дробина, белковый осадок из сепараторов. За счет того, что белковый осадок , хмельная дробина содержит горечи, их не могут использовать в качестве добавок к кормам животных, поэтому их либо ожигают (перептобельно) либо передают на биологическое обезвреживание.

В спиртовом производстве отходом является барда, состав которой зависит от качества используемого сырья (картофель, зерно). Высушенная барда используется в качестве добавок к корму. Количество плотных отходов действует на выбор метода их обеззараживания. Так, патогенные микробы должны быть обезврежены полностью. Эффективный способ - сжигание. Если отходом является биомасса клеток стрептомицетов, их достаточно убить нагревом, далее их можно уже использовать в качестве добавок к кормам, в качестве удобрений. Но здесь необходимо исключить их сенсибилирующее действие. В аэробных очистных сооружениях, где происходит обезвреживание отходов, лимитирующими факторами выступают качество и площадь биопленки, состоящий из микро-макрофлоры и фауны. При этом необходимо убедиться, что привносимые плотные отходы, которые богаты органическими веществами не приведут к ухудшению работы аэротенков.

Жидкие отходы в биотехнологических производствах достаточно разнообразны по своему составу. Это объясняется неполным использованием биообъектами компонентов, входящих в состав питательных сред; присутствием растворителей, используемых для экстракции конечных продуктов; наличием веществ, секретируемых клетками. Жидкие отходы дрожжевых заводов, где производят дрожжи на мелассном сусле, содержат органические и минеральные вещества: этанол, углеводы, общий азот, зольные элементы. Отходы, образующиеся от 1000 т мелассы, соответствуют бытовым стокам города с населением около 0.5 млн. жителей. Подобные жидкие отходы подвергают микробиологической обработке. Сточные воды отдельных предприятий неравноценны. Одни могут быть названы условно чистыми, поскольку они почти не отличаются от потребляемой в производствах природной воды (конденсаты, вода из теплообменников). Другие воды являются загрязненными неорганическими и органическими примесями, которые попадают от сырья, загрязненного при транспортировке; от оборудования. Отличительной особенностью биотехнологических процессов, основанных на выделении метаболитов из культуральных жидкостей, является неравновесное соотношение целевого продукта и жидкости. В подобных производствах количество жидких отходов больше, чем плотных.

Газообразные отходы в процессах биологической технологии немногочисленны в ассортименте. Энергетическим субстратом для биообьектов является углеводы. В аэробных и анаэробных условиях из них образуется диоксид углерода. Выделяющийся диоксид углерода улавливается и утилизируется в пищевой промышленности в качестве хладагента. "Отработанный воздух" биотехнологических процессов не должен поступать в атмосферу без очистки и обезвреживания. "Отработанный воздух" представляет собой высокодисперсный аэрозоль, в котором дисперсной фазой оказываются капельки жидкости и м/организмы. Они легко переносятся воздушными потоками и на большие расстояния и не исключено неблагоприятное воздействие на людей. "Отработанный воздух" должен быть термически обработан и только после этого подвергаегся фильтрационной очистке.

Исскуственное вмешательство в генетические структуры, их модификация с целью получения совершенных биообъектов, вызывает структурную перестройку в организме, что точно и своевременно нельзя спрогнозировать.Это вызывает беспокойство. Это сейчас актуально когда на рынок поступаю модефицированно измененные продукты питания.

9