Практическая работа №5 Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5

ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОКРАШЕННОМ СОСТОЯНИИ

Цель занятия

Проведение окрашивания микроорганизмов сложным способом.

Слушатель должен знать

1.Простые и сложные методы окраски бактерий.

Слушатель должен уметь

1. Приготовить мазок-препарат, окрашенный сложным способом по Граму.

2. Провести микроскопию в светлом поле.

3. Провести дезинфекцию и утилизацию.

Материалы и оборудование. Микроскоп с конденсорами светлого поля. Предметные стекла, спиртовка, спички, красители (генциановый фиолетовый, водный раствор фуксина (разведение 1/10), люголь, спирт этиловый 96 %, штатив, бактериальная петля, пинцет, промывалка с водой или колба с водой и пипеткой, фильтровальная бумага, зубочистки.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного (рис.1).

Рисунок 1 – Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, а у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генциан фиолетовым и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательного такого комплекса не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обработки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окраски фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Задание 1

1.Подготовить рабочее место к работе.

2.Приготовить мазок препарата зубного налета:

• небольшое количество зубного налета снять острым концом спички или зубочистки (материал берут из межзубных промежутков или у шейки зуба);

• растереть на обезжиренном предметном стекле круг диаметром около 1 см (растирают посуху). Затем пипеткой или бактериальной петлей внести каплю воды постепенно готовя однородную взвесь и равномерно распределяя ее по поверхности стекла;

• мазок высушить на воздухе и зафиксировать - предметное стекло (мазком вверх) держа пинцетом троекратно проводят через пламя горелки (стекло не должно быть холодным или сильно горячим).

3.Окраска по Граму (рисунок 2 зарисовать в тетрадь, подписать время действия красителей). Окраску необходимо проводить в следующей последовательности:

• окрасить мазок первым красителем генциановым фиолетовым, аккуратно, используя пинцет, положить на мазок фильтровальную бумагу, смоченную красителем (или положить сухую окрашенную фильтровальную бумагу смочив ее дистиллированной водой методом конверта). Время окрашивания 2 минуты;

• бумагу удалить, избыток краски слить в лоток, не промывая для закрепления красителя на препарат нанести пипеткой несколько капель раствора Люголя на 1 минуту (до почернения);

• раствор Люголя слить, не промывая водой, на препарат нанести несколько капель 96% спирта, на 30 секунд, осторожно покачивая стекло, обесцвечивание проводить до отхождения фиолетовых капель – струи краски;

• тщательно смыть спирт водой;

• мазок окрасить водным фуксином (2 минуты);

• промыть водой и высушить кусочками фильтровальной бумаги (поверхность мазка осторожно промокнуть, остальную часть стекла можно протереть).

Рисунок 2 – Схема окраски по Граму

4.Провести микроскопию приготовленного микропрепарата с конденсором светлого поля (конденсор поднят). Описать и зарисовать микропрепараты (формы бактерий, взаимное расположение по отношению друг к другу при делении, смотри пример на рисунках 3, 4).

5.Провести дезинфекцию рабочего места и утилизацию микропрепарата. Провести дезинфекцию рук.

Рисунок 3 – Мазок зубного налета окраска по Граму

Рисунок 4 – Морфологические и тинкториальные свойства бактерий